Giardia duodenum သည် giardiasis ဖြစ်စေသော ကပ်ပါးသက်ရှိတစ်မျိုးဖြစ်ပြီး အထူးသဖြင့် ဝမ်းပျက်ဝမ်းလျှောရောဂါလက္ခဏာရှိသော ကလေးသူငယ်များတွင် အူလမ်းကြောင်းပိုးဝင်ခြင်း အထူးသဖြင့် အဖြစ်များသည်။extracellular G. duodenalis သည် intracellular oligomerization-like receptor 3 (NLRP3) binding nucleotides ၏ အသက်ဝင်မှုကို အစပျိုးစေပြီး extracellular vesicle (EV) လျှို့ဝှက်ချက်မှတစ်ဆင့် လက်ခံထားသော ရောင်ရမ်းမှုတုံ့ပြန်မှုများကို ထိန်းညှိပေးကြောင်း ယခင်က ကျွန်ုပ်တို့အစီရင်ခံထားပါသည်။သို့သော်၊ ဤလုပ်ငန်းစဉ်တွင်ပါ၀င်သော ရောဂါပိုးနှင့်ဆက်စပ်နေသော duodenococcal EV (GEV) ၏ တိကျသော မော်လီကျူးပုံစံများနှင့် giardiasis ရှိ NLRP3 ရောင်ရမ်းခြင်း၏အခန်းကဏ္ဍကို ရှင်းလင်းစွာဖော်ပြရန်ကျန်ရှိနေပါသည်။
GEV တွင် ပြန်လည်ပေါင်းစပ်ထားသော eukaryotic expression plasmids pcDNA3.1(+)-alpha-2 နှင့် alpha-7.3 giardins ကို တည်ဆောက်ထားပြီး mouse ၏ အဓိက peritoneal macrophages အဖြစ်သို့ ကူးစက်ကာ ရောင်ရမ်းမှုပစ်မှတ် မော်လီကျူး caspase-1 ကို တိုင်းတာခြင်းဖြင့် ရှာဖွေတွေ့ရှိခဲ့သည်။p20 ဖော်ပြချက်အဆင့်ကို စစ်ဆေးခဲ့သည်။.G. duodenalis alpha-2 နှင့် alpha-7.3 giardines ကို NLRP3 ရောင်ရမ်းခြင်း (NLRP3၊ pro-interleukin-1 beta [IL-1β]၊ pro-caspase-1 နှင့် caspase-1 p20) ၊ IL လျှို့ဝှက်ချက်ကို တိုင်းတာခြင်းဖြင့် မူလကဖော်ထုတ်ခဲ့သည်။1β အဆင့်များ၊ apoptotic spotted protein (ASC) oligomerization အဆင့်များ၊ နှင့် NLRP3 နှင့် ASC ၏ immunofluorescent ဒေသထွက်မှု။G. duodenalis ၏ရောဂါဖြစ်ပွားနိုင်မှုတွင် NLRP3 ရောင်ရမ်းခြင်း၏အခန်းကဏ္ဍကို NLRP3 တက်ကြွစွာပိတ်ဆို့ခြင်း (NLRP3 ပိတ်ဆို့ထားသောကြွက်များ) နှင့် ခန္ဓာကိုယ်အလေးချိန်၊ duodenal parasitic load နှင့် duodenal တစ်ရှူးများကိုစောင့်ကြည့်ခဲ့သည့်ကြွက်များကိုအသုံးပြု၍ အကဲဖြတ်ခဲ့ပါသည်။ထို့အပြင်၊ Hiardines alpha-2 နှင့် alpha-7.3 တို့သည် NLRP3 inflammasome မှတစ်ဆင့် vivo တွင် IL-1β လျှို့ဝှက်ချက်ကို ဖြစ်ပေါ်စေသည်ဆိုသည်ကို ကျွန်ုပ်တို့ စုံစမ်းစစ်ဆေးခဲ့ပြီး ကြွက်များတွင် G. duodenalis ၏ရောဂါဖြစ်ပွားမှုတွင် ဤမော်လီကျူးများ၏အခန်းကဏ္ဍကို ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။
Alpha-2 နှင့် alpha-7.3 giardines တို့သည် NLRP3 ရောင်ရမ်းမှုကို ဗီတိုအတွင်းတွင် လှုံ့ဆော်ပေးသည်။၎င်းသည် p20 caspase-1 ကိုအသက်သွင်းခြင်း၊ NLRP3၊ pro-IL-1βနှင့် pro-caspase-1 ပရိုတိန်းများ၏အသုံးအနှုန်းများတိုးလာခြင်း၊ IL-1βလျှို့ဝှက်ချက်သိသိသာသာတိုးလာခြင်း၊ အတွင်းရှိ ASA အစက်အပြောက်များဖွဲ့စည်းခြင်း၊ cytoplasm နှင့် ASA oligomerization ၏နိဂုံး။NLRP3 ရောင်ရမ်းခြင်း လိင်တံဆုံးရှုံးခြင်းသည် ကြွက်များတွင် G. duodenalis ၏ရောဂါဖြစ်ပွားမှုကို ပိုမိုဆိုးရွားစေသည်။NLRP3 ပိတ်ဆို့ထားသော ကြွက်များ၏ ရလဒ်အားဖြင့် အရေခွံဖြင့် ကုသထားသော ကြွက်များသည် trophozoites အရေအတွက် တိုးများလာပြီး duodenal villi ကို ပြင်းထန်စွာ ပျက်စီးစေကာ ကျုံ့သွားကာ အကိုင်းအခက်များဖြင့် ထူးခြားသော necrotic crypts များဖြင့် ပြသထားသည်။vivo စမ်းသပ်ချက်များတွင် giardines alpha-2 နှင့် alpha-7.3 သည် NLRP3 inflammasome မှတစ်ဆင့် IL-1β ၏လျှို့ဝှက်ချက်ကို ဖြစ်ပေါ်စေနိုင်ပြီး giardines alpha-2 နှင့် alpha-7.3 တို့ဖြင့် ကာကွယ်ဆေးထိုးခြင်းသည် ကြွက်များတွင် G. duodenalis ၏ရောဂါဖြစ်ပွားမှုကို လျော့နည်းစေကြောင်း ပြသခဲ့သည်။
စုစည်းထားသော ဤလေ့လာမှု၏ရလဒ်များအရ giardia alpha-2 နှင့် alpha-7.3 သည် အိမ်ရှင် NLRP3 ရောင်ရမ်းမှုကို ထိန်းညှိပေးပြီး giardiasis ကိုကာကွယ်ရန် အလားအလာရှိသော ကြွက်များတွင် G. duodenalis ၏ကူးစက်မှုကို လျှော့ချနိုင်သည်ဟု အကြံပြုထားသည်။
Giardia duodenum သည် အူသိမ်အတွင်းနေထိုင်သော ပြင်ပဆဲလ်ပရိုတိုဇိုးကပ်ပါးတစ်မျိုးဖြစ်ပြီး နှစ်စဉ်နှစ်တိုင်း အထူးသဖြင့် ဖွံ့ဖြိုးဆဲနိုင်ငံများရှိ ကလေးသူငယ်များတွင် giardiasis ဝမ်းလျှောရောဂါဖြစ်ပွားမှု သန်း 280 ကို ဖြစ်စေသည်။သောက်သုံးရေ သို့မဟုတ် အစာအိမ်အတွင်းသို့ အမ်အူဒင်းနမ်အရေအိတ်များပါ၀င်သော အစားအစာများမှ ရောဂါပိုးဝင်ရောက်ပြီး အစာအိမ်အရည်များအတွင်းသို့ စွန့်ထုတ်သွားပါသည်။Giardia duodenum trophozoites များသည် duodenal epithelium နှင့် တွဲလျက် ပျို့အန်ခြင်း၊ အော့အန်ခြင်း၊ ဝမ်းလျှောခြင်း၊ ဝမ်းဗိုက်နာခြင်းနှင့် ကိုယ်အလေးချိန်ကျခြင်းတို့ ဖြစ်စေသည်။ခုခံအားကျဆင်းမှုနှင့် cystic fibrosis ရှိသူများသည် ရောဂါပိုးကူးစက်ခံရနိုင်ချေရှိသည်။ပါးစပ်နှင့် စအိုလိင်မှတဆင့် ပိုးဝင်နိုင်သည်။[2]metronidazole၊ tinidazole နှင့် nitazoxanide ကဲ့သို့သော ဆေးဝါးများသည် duodenal ပိုးဝင်ခြင်းအတွက် ဦးစားပေး ကုသမှုရွေးချယ်စရာများ [3]။သို့သော်၊ ဤဓာတုကုထုံးဆေးများသည် ပျို့အန်ခြင်း၊ ကင်ဆာဖြစ်ပွားခြင်း နှင့် မျိုးရိုးဗီဇအဆိပ်သင့်ခြင်းကဲ့သို့သော ဆိုးရွားသောဘေးထွက်ဆိုးကျိုးများကို ဖြစ်စေသည်။ထို့ကြောင့် G. duodenalis ကူးစက်မှုကို ကာကွယ်ရန် ပိုမိုထိရောက်သော နည်းဗျူဟာများကို တီထွင်ရန် လိုအပ်ပါသည်။
Inflammasomes များသည် မွေးရာပါကိုယ်ခံအားတုံ့ပြန်မှု၏ တစ်စိတ်တစ်ပိုင်းဖြစ်သည့် cytosolic ပရိုတိန်းရှုပ်ထွေးသော အမျိုးအစားတစ်ခုဖြစ်ပြီး ရောဂါပိုးဝင်ရောက်မှုမှ ခုခံကာကွယ်ရန်နှင့် ရောင်ရမ်းမှုတုံ့ပြန်မှုများကို ပြေလည်အောင်ဆောင်ရွက်ပေးရန် ကူညီပေးသည်။ဤရောင်ရမ်းမှုမျိုးတွင်၊ nucleotide-binding oligomerization (NOD) receptor 3 (NLRP3) nucleotide-binding oligomerization (NLRP3) nucleotide-binding-like inflammasomes ကို အမျိုးမျိုးသော ရောဂါပိုး/ပျက်စီးခြင်းဆိုင်ရာ မော်လီကျူးပုံစံများဖြင့် သိရှိနိုင်သောကြောင့် အကျယ်တဝင့် လေ့လာခဲ့သည် (PAMP/ DAMP) သည် မွေးရာပါ ကိုယ်ခံအားစနစ်ကို အသိအမှတ်ပြုပြီး အသက်သွင်းသည်။ရောင်ရမ်းသောရောဂါများစွာတွင် အူတွင်း homeostasis ကိုထိန်းညှိပေးသည်။၎င်းတွင် pattern recognition receptor (PRR) NLRP3၊ adapter apoptotic spotted protein (ASC) နှင့် effector procaspase-1 သို့မဟုတ် procaspase-11 တို့ ပါဝင်သည်။NLRP3 ရောင်ရမ်းမှုသည် Neospora caninum [9]၊ Paracoccidioides brasiliensis [10] နှင့် Leishmania လေ့လာမှုများတွင် တွေ့ရှိထားသည့်အတိုင်း ရောဂါပိုးဝင်ရောက်မှုကို ဆန့်ကျင်သည့် အိမ်ရှင်အဖြစ် လုပ်ဆောင်သည်။[11]၊ သို့သော် NLRP3 ရောင်ရမ်းမှုအား အသက်သွင်းခြင်းသည် အကာအကွယ်ကိုယ်ခံအားတုံ့ပြန်မှုများကို ကန့်သတ်ပေးပြီး ဥပမာအားဖြင့် ပိုးကောင်များ [12] တွင် ရောဂါဖြစ်ပွားမှုကို ပိုမိုဆိုးရွားစေကြောင်း အစီရင်ခံထားပါသည်။ကျွန်ုပ်တို့၏ယခင်တွေ့ရှိချက်များအပေါ် အခြေခံ၍ extracellular G. duodenalis သည် NLRP3 ရောင်ရမ်းမှုကို လှုံ့ဆော်ပေးပြီး extracellular vesicles (EVs) [13] ကို လျှို့ဝှက်ခြင်းဖြင့် လက်ခံဆောင်ရွက်ပေးသော ရောင်ရမ်းမှုကို လှုံ့ဆော်ပေးကြောင်း အစီရင်ခံတင်ပြပါသည်။သို့သော်၊ vivo ရှိ G. duodenalis ကူးစက်မှုတွင် NLRP3 ရောင်ရမ်းခြင်း၏အခန်းကဏ္ဍကို ဆုံးဖြတ်ရန်ကျန်နေသေးသည်။
Giardins ကို မူလက G. duodenalis cytoskeleton ၏ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာအစိတ်အပိုင်းများအဖြစ်ဖော်ပြခဲ့ပြီး trophozoite လှုပ်ရှားမှုနှင့် အူသိမ်အတွင်းရှိ epithelial cell attachment တွင် အရေးပါသောအခန်းကဏ္ဍမှပါဝင်ပါသည်။ပတ်ဝန်းကျင်နှင့် လိုက်လျောညီထွေ ပိုမိုကောင်းမွန်စွာ လိုက်လျောညီထွေဖြစ်အောင် ၎င်းတို့၏ ရောဂါဖြစ်ပွားနိုင်ချေကို တိုးလာစေရန်အတွက် G. duodenalis trophozoites များသည် flagella 8 ခု၊ အလယ်ကိုယ်ထည် 1 ခုနှင့် ventral disc 1 ခု ပါဝင်သော ထူးခြားသော cytoskeletal ဖွဲ့စည်းပုံကို တီထွင်ခဲ့သည်။Giardia duodenum ၏ trophozoites များသည် အူသိမ်အပေါ်ပိုင်း၊ အထူးသဖြင့် duodenum အတွင်းသို့ ထိုးဖောက်ဝင်ရောက်ရန် ၎င်းတို့၏ cytoskeleton ကို အသုံးပြု၍ enterocytes များနှင့် ချိတ်ဆက်ကြသည်။၎င်းတို့သည် ဆဲလ်ဇီဝဖြစ်စဉ်ကို အသုံးပြု၍ epithelial ဆဲလ်များသို့ အဆက်မပြတ် ရွှေ့ပြောင်းနေထိုင်ပြီး တွယ်ကပ်နေပါသည်။ထို့ကြောင့်၊ ၎င်းတို့၏ cytoskeleton နှင့် virulence အကြား နီးကပ်သော ဆက်ဆံရေးရှိသည်။Giardia duodenum အတွက် သီးသန့် Giardines များသည် cytoskeleton တည်ဆောက်ပုံ [15] ၏ အစိတ်အပိုင်းများဖြစ်ပြီး α-, β-, γ-, နှင့် δ-giardines ဟူ၍ အတန်းလေးမျိုး ခွဲခြားထားသည်။α-giardin မိသားစုတွင် အဖွဲ့ဝင် 21 ဦး ရှိပြီး ၎င်းတို့အားလုံးတွင် ကယ်လ်စီယမ်အားကိုးဖြင့် ဖော့စဖိုလစ်ပစ်များကို ချည်နှောင်နိုင်စွမ်းရှိသည်။၎င်းတို့သည် cytoskeleton ကို ဆဲလ်အမြှေးပါးနှင့် ချိတ်ဆက်ပေးသည်။G. duodenalis ကြောင့်ဖြစ်သောဝမ်းပျက်ဝမ်းလျှောရောဂါရှိသူများတွင် α-giardins သည် ရောဂါပိုးကူးစက်ခံရစဉ်တွင် ပြင်းထန်စွာဖော်ပြပြီး ခုခံအားကျဆင်းမှု [17]။ကြွက်များတွင် giardiasis ကိုကာကွယ်ပေးသည့် Giardia alfa-1 ကိုအခြေခံထားသော Heterologous vaccines များသည် ကာကွယ်ဆေးဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုအတွက် ဖြစ်နိုင်ချေရှိသော အန်တီဂျင်များဖြစ်သည် [18]။Alpha-8 giardin သည် ပလာစမာအမြှေးပါးနှင့် flagella တို့တွင် ဒေသစံထားသော်လည်း ventral disc တွင်မဟုတ်ဘဲ၊ G. duodenalis တွင် trophozoites များ၏ ရွေ့လျားမှုနှင့် ကြီးထွားနှုန်းကို မြှင့်တင်ပေးသည်။Alpha-14 giardin သည် flagella ပေါ်ရှိ microtubule တည်ဆောက်ပုံများနှင့် တွယ်ဆက်ပြီး G. duodenalis [20] ၏ရှင်သန်နိုင်စွမ်းကို သက်ရောက်မှုရှိသည်။Alpha-11 giardine သည် ဘဝစက်ဝန်းတစ်လျှောက်တွင် များပြားစွာတည်ရှိပြီး alpha-11 giardine ကို အလွန်အကျွံဖော်ပြခြင်းသည် G. duodenalis ကိုယ်တိုင် [21] ကို ပျက်စီးစေသည်။သို့သော်၊ alpha-2 giardine နှင့် alpha-7.3 giardine သည် G. duodenalis ကူးစက်မှုနှင့် ၎င်းတို့၏ အရင်းခံ ယန္တရားများကို ကာကွယ်ခြင်း ရှိ၊မရှိ မရှင်းလင်းပါ။
ဤလေ့လာမှုတွင်၊ ပြန်လည်ပေါင်းစပ်ထားသော eukaryotic expression plasmids pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine နှင့် pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine တို့သည် host NLRP3 ကိုအသက်သွင်းရန်အတွက် mouse primary peritoneal macrophages အဖြစ်သို့ ကူးပြောင်းသွားပါသည်။ထို့နောက် ရောင်ရမ်းသော ပစ်မှတ်များကို စစ်ဆေးခဲ့သည်။G. duodenalis ၏ရောဂါဖြစ်ပွားမှုတွင် NLRP3 ရောင်ရမ်းခြင်း၏အခန်းကဏ္ဍကိုလည်း အကဲဖြတ်ပြီး alpha-2 နှင့် alpha-7,3 giardines တို့သည် vivo တွင် NLRP3 ရောင်ရမ်းမှုကို လှုံ့ဆော်ပေးသည်ရှိမရှိ လေ့လာဆန်းစစ်ပြီး အဆိုပါ giardines ၏ အခန်းကဏ္ဍနှစ်ခုကို ရောဂါဖြစ်ပွားနိုင်စေသည်ဟု ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ G. duodenalis ။ကျွန်ုပ်တို့၏ ဘုံရည်မှန်းချက်မှာ G. duodenalis ကူးစက်မှုကို ကာကွယ်ရန်အတွက် အလားအလာရှိသော ပစ်မှတ်များကို ဖော်ထုတ်ရန်ဖြစ်သည်။
တောရိုင်းအမျိုးအစား (WT) C57BL/6 မှ အသက် 5 မှ 8 ပတ်အထိ အမျိုးသမီး ကြွက်များကို Liaoning Changsheng စမ်းသပ်တိရစ္ဆာန်ဌာန (Liaoning, China) မှ ဝယ်ယူခဲ့သည်။ကြွက်များသည် ရေကို အခမဲ့သုံးစွဲနိုင်သည်၊ ပိုးသတ်ထားသောအစားအစာများရရှိပြီး ၁၂/၁၂ နာရီအလင်း/အမှောင်စက်ဝန်းတွင် ထိန်းသိမ်းထားကြသည်။ရောဂါပိုးမကူးစက်မီကြွက်များသည် ampicillin (1 mg/mL)၊ vancomycin (1 mg/mL) နှင့် neomycin (1.4 mg/mL) (ရှန်ဟိုင်း၊ တရုတ်၊ တရုတ်၊ အတုအပမှဝယ်ယူသော သက်ရှိအတုများ) နှင့် ဖြည့်စွက်ထားသော သောက်ရေထဲတွင် ပဋိဇီဝဆေး ad libitum ကြော်ငြာ libitum ကို ရရှိခဲ့သည်။ [ 22 ]]24 နာရီကြာ စားသောက်နိုင်မှု ဆုံးရှုံးသွားသော ကြွက်များသည် သားအိမ်ခေါင်းအရွေ့ပြောင်းခြင်းကြောင့် ခန္ဓာကိုယ်အလေးချိန် 20% ဆုံးရှုံးသွားပါသည်။
WB G. duodenalis trophozoites (American Type Culture Collection, Manassas, USA) ကို 12.5% ​​​​သန္ဓေသား bovine serum (FBS; Every Green, Zhejiang, China) နှင့် 0.1% နွားနို့သည်းခြေ (Sigma-Aldrich, St. Missouri, USA၊ )USA) မိုက်ခရိုအေရိုးဗစ်အခြေအနေများအောက်တွင်။ဆက်စပ်နေသော trophozoite များကို ရေခဲပေါ်တွင် စုဆောင်းပြီး နောက်ထပ်မျိုးပွားရန်အတွက် 1:4 အချိုးဖြင့် ဖြတ်သန်းသွားပါသည်။
ယခင်က ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း Giardia duodenum cysts များကို လှုံ့ဆော်ပေးခဲ့ပြီး၊ trophozoites များကို logarithmic အဆင့်တွင် ရိတ်သိမ်းပြီးနောက် အလတ်စား၊ pH 7.1 (မွမ်းမံထားသော TYI-S-33) ဖြင့် 1 × 106 trophozoites/mL တွင် အရည်ပျော်သွားသည်။သည်းခြေရည်စူးစိုက်မှု 0.05% အလယ်အလတ်)။Trophozoites များကို လော့ဂရစ်သမ်ကြီးထွားမှုအဆင့်အထိ 37°C တွင် anaerobic အခြေအနေအောက်တွင် မွေးမြူထားသည်။အလတ်စားကို cyst inducing medium (pH 7.8; ပြုပြင်ထားသော TYI-S-33 ကြားခံအား 1% သည်းခြေရည်စူးစိုက်မှု) နှင့် ယဉ်ကျေးမှု G. duodenalis တွင် 37°C တွင် 48-96 နာရီကြာ၊ အဏုကြည့်မှန်ဘီလူးအောက်တွင် အစီအစဥ်များဖြစ်ပေါ်ခြင်းကို သတိပြုမိပါသည်။trophozoites အများစုကို cysts များဖွဲ့စည်းရန် လှုံ့ဆော်ပြီးနောက်၊ ကျန်ရှိသော trophozoite များကို lyse လုပ်ဖို့ ယဉ်ကျေးမှုအရောအနှောကို ရိတ်သိမ်းပြီး ကျန်ရှိသော trophozoite များကို lyse လုပ်ဖို့ ပိုးမွှားရှိသော deionized water တွင် ပြန်လည်ရပ်ဆိုင်းခဲ့သည်။ကြွက်များတွင် အစာအိမ်ပြွန်မှတစ်ဆင့် နောက်ဆက်တွဲခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုများအတွက် ဆီးအိတ်များကို ရေတွက်ပြီး 4°C တွင် သိမ်းဆည်းထားသည်။
Giardia extracellular vesicles (GEVs) များသည် ယခင်က ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း ကြွယ်ဝလာပါသည်။လော့ဂရစ်သမ် ကြီးထွားမှုအဆင့်ရှိ Trophozoites များကို exosome-depleted FBS (Biological Industries, Beit-Haemek, Israel) ဖြင့် ပြင်ဆင်ထားသော TYI-S-33 ကြားခံအလတ်စားတွင် ပြန်လည်ရပ်ဆိုင်းပြီး 12 နာရီကြာ ပေါက်ဖွားသည်။2000 g တွင် centrifugation ဖြင့် ယဉ်ကျေးမှု supernatant မှ 10 မိနစ်၊ 45 မိနစ်အတွက် 10,000 g နှင့် 60 မိနစ်အတွက် 100,000 g တို့ဖြစ်သည်။ဖော့စဖိတ်ဆားရည် (PBS) သည် BCA ပရိုတင်းစမ်းသပ်ကိရိယာ (Thermo Fisher Scientific၊ Waltham၊ MA, USA) တွင် ပျော်ဝင်ပြီး -80°C. သို့မဟုတ် နောက်ထပ်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုများအတွက် တိုက်ရိုက်အသုံးပြု၍ တိုင်းတာထားသော ဖော့စဖိတ်ဆားရည် (PBS) တွင် ပျော်ဝင်ပါသည်။
မူလ mouse peritoneal macrophages ကို ယခင်က ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း ပြင်ဆင်ခဲ့သည်။အတိုချုပ်အားဖြင့်၊ ကြွက်များ (အသက် 6-8 ပတ်) သည် (Intraperitoneally [ip]) ကို 2.5 ml of 2.98% Difco အရည် thioglycol medium (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) နှင့် အာခေါင် 3-4 ခု တိုက်ကျွေးခဲ့သည်။euthanasia ပြီးနောက် ကြွက်များ၏ဝမ်းဗိုက်အတွင်းမှ macrophages များကို စုဆောင်းပြီး 1000 g တွင် 3 ကြိမ် centrifuged 10 မိနစ်။ရိတ်သိမ်းထားသောဆဲလ်များကို CD11b အမှတ်အသားကို အသုံးပြု၍ ဆဲလ်သန့်စင်မှု > 98% အထိ၊ ထို့နောက် 6-well cell culture plates (4.5 x 106 cells/ well) နှင့် 10% FBS (Bioindustry) တွင် 10% FBS (Bioindustry) ဖြင့် ပေါက်ဖွားသည်ကို တွေ့ရှိရသည်။နှင့် 5% CO2 ။
RNA ကို 1 × 107 trophozoites ၏ 1 ml တွင် TRIzol ဓာတ်ပစ္စည်းများ (Vazyme, Nanjing, China) မှ ထုတ်ယူခဲ့သည်၊ MonScript dsDNase (Monad၊ Wuhan, China) ကို အသုံးပြု၍ မျိုးရိုးဗီဇ DNA စုစုပေါင်းမှ G. duodenalis RNA ကို ထုတ်ယူခဲ့သည် ထုတ်လုပ်သူ၏ညွှန်ကြားချက်အရ MonScript RTIIII Super Mix (Monad) ကိုအသုံးပြုခြင်း။
ပစ်မှတ် G. duodenalis ဗီဇအတွက် CDS စီစဥ်အချက်အလက်ကို NCBI GenBank မှ ရယူခဲ့သည်။ပစ်မှတ် ဗီဇတစ်ခုစီအတွက် တိကျသော ချောမွေ့မှုမရှိသော cloning primer များကို ဒီဇိုင်းထုတ်ရန် Primer 5.0 ကို အသုံးပြုပါ။ရှေ့သို့ primer (5′-3′) တွင် အပိုင်းသုံးပိုင်းပါဝင်သည်- linearized vector pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) နှင့် ထပ်နေသော codons ATG နှင့် GNN (ပထမအခြေခံသည် G မဟုတ်ပါက)။၎င်းသည် စကားရပ်၏ စွမ်းဆောင်ရည်ကို မြှင့်တင်ရန် လုပ်ဆောင်သည်။ထို့အပြင်၊ အနည်းဆုံး 16 bp ပေါင်းစပ်အခြေစိုက်စခန်းများ (GC ပါဝင်မှု 40–60%/Tm ခန့်မှန်းခြေ 55°C)။ပြောင်းပြန် primer (5′-3′) တွင် အပိုင်းနှစ်ပိုင်း ပါ၀င်သည်၊ EcoRV-linearized vector pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) နှင့် ပေါင်းစပ်အခြေခံ အနည်းဆုံး 16 bp နှင့် ထပ်နေသော အစီစဥ်တစ်ခု ပါဝင်သည်။(နောက်ဆုံးမှတ်တိုင်နှစ်ခုမှလွဲ၍)bases) recombinant plasmids များကို ၎င်းတို့၏တံဆိပ်တပ်ထားသော ပရိုတင်းများကို ဖော်ပြခွင့်ပြုရန် AA သို့မဟုတ် GA ကဲ့သို့သော codon တစ်ခု။primer sequences များကို ဇယား 1 တွင်ဖော်ပြထားပြီး Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, China) မှ ပေါင်းစပ်ဖန်တီးထားပါသည်။
ပြင်ဆင်ထားသော G. duodenalis cDNA ကို နမူနာအဖြစ် အသုံးပြု၍ ပစ်မှတ်များကို Pfu DNA polymerase (Tiangen၊ Beijing, China) သို့မဟုတ် Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Beijing, China) ကို အသုံးပြု၍ ချဲ့ထွင်ခဲ့ပါသည်။eukaryotic expression vector plasmid pcDNA3.1(+) ကို ကန့်သတ်အင်ဇိုင်း EcoRV ဖြင့် မျဉ်းသားပြီး Fast AP (Thermo Fisher Scientific) ကို အသုံးပြု၍ ဖော့စဖိုရီဖြင့် ပြုလုပ်ထားသည်။Linearized pcDNA3.1(+) အပိုင်းအစများနှင့် ချဲ့ထွင်ထားသော ပစ်မှတ်မျိုးရိုးဗီဇအပိုင်းအစများကို DNA ဂျယ်သန့်စင်ကိရိယာ (Tiangen) အသုံးပြု၍ သန့်စင်ပြီး Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific) ကို အသုံးပြု၍ တိုင်းတာပါသည်။pcDNA3.1(+) အပိုင်းအစနှင့် ပစ်မှတ်မျိုးရိုးဗီဇအပိုင်းအစတစ်ခုစီကို MonClone single assembly cloning mix (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, China) ဖြင့် ပြန်လည်ပေါင်းစပ်ထားပြီး Comate Bioscience Company Limited (Changchun, China) ကိုအသုံးပြု၍ DNA စီစစ်ခြင်းဖြင့် အတည်ပြုခဲ့သည်။.
Endotoxin-free plasmids pcDNA3.1(+)-alpha-2 နှင့် pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 ကို SanPrep Endotoxin-free Plasmid Mini Kit (Sangon Biotech) ကို အသုံးပြု၍ ထုတ်လုပ်ခဲ့သည်။elution buffer တွင် EDTA သည် transfection assay ကို အနှောင့်အယှက်မဖြစ်စေကြောင်း သေချာစေရန် အာရုံစူးစိုက်မှုကို 500 ng/µl အထက်တွင် ထိန်းသိမ်းထားသည်။Primary mouse peritoneal macrophages ကို RPMI 1640 အလတ်စား (Biological Industries) ဖြင့် ရေတွင်း 6 ပြားတွင် 12 နာရီကြာ ပျိုးထောင်ပြီးနောက် ဆဲလ်များကို ပင်နီဆီလင်နှင့် စထရက်တိုမိုက်စင် ဖယ်ရှားရန်အတွက် ပူနွေးသော PBS ဖြင့် ၃ ကြိမ် ဆေးကြောပြီး အလယ်အလတ် ဖြည့်စွက်ဆေးဖြင့် ဖြည့်စွက်ထားသည်။Endotoxin-free plasmids pcDNA3.1(+)-alpha-2 နှင့် pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2.5 μg) ကို Opti-MEM လျှော့ချထားသော သွေးရည်ကြည်အလယ်အလတ် (Gibco၊ Thermo Fisher Scientific) ၏ 125 μl တွင် ရောနှောထားသည်။.ထို့နောက် Lipofectamine 2000 transfection reagent (Invitrogen၊ Thermo Fisher Scientific) ၏ 5 µl ကို နိမ့်သောသွေးရည်ကြည် Opti-MEM လတ်မှတ်၏ 125 µl တွင် အရည်ပျော်သွားသည်။အရည်ဖျော်ထားသော endotoxin-free plasmid ကို Lipofectamine 2000 နှင့် ရောစပ်ပြီး အရောအနှောကို အခန်းအပူချိန်တွင် 5 မိနစ်ကြာအောင်ထားခြင်းဖြင့် liposome-DNA ရှုပ်ထွေးမှုများကို ပြင်ဆင်ပါ။ကွန်ပေါင်းများကို ရေတွင်းတစ်ခုစီရှိ ဆဲလ်များသို့ သီးခြားစီ လွှဲပြောင်းပြီး ဖြည်းညှင်းစွာ ရောမွှေပါ။4 နာရီကြာပြီးနောက်၊ ဆဲလ်ယဉ်ကျေးမှုအလတ်စားကို ပြီးပြည့်စုံသော RPMI 1640 အလတ်စား 2 ml ဖြင့် အစားထိုးခဲ့ပြီး ယဉ်ကျေးမှုကို 24 နာရီကြာ ဆက်လက်ထားရှိခဲ့သည်။လတ်ဆတ်သောဆဲလ် ယဉ်ကျေးမှုအလယ်အလတ်ကို ဆဲလ်များထဲသို့ ပေါင်းထည့်ခဲ့ပြီး စစ်ဆေးမှုပုံစံပေါ်မူတည်၍ အချိန်အချက်များစွာအတွက် ပေါက်ဖွားခဲ့သည်။
ယခင်က ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း supernatants နှင့် cell lysates များမှ ပရိုတင်းနမူနာများကို ပြင်ဆင်ခဲ့ပါသည်။pro-IL-1β၊ pro-caspase-1၊ caspase-1 p20၊ NLRP3၊ β-actin နှင့် His-tag အတွက် အမြှေးပြောင်းခြင်း ဘောင်များသည် 200 mA/90 မိနစ်ဖြစ်သည်။Interleukin 1β (IL-1β; R&D စနစ်များ၊ Minneapolis၊ Minnesota၊ USA) အတွက်၊ caspase-1 (p20) (Adipogen၊ Switzerland) နှင့် NLRP3 (Adipogen SA၊ Epalinges၊ Switzerland) နှင့် သူ၏ tag ကို ပစ်မှတ်ထားသည့် 1:5000 (Amylet Scientific၊ Wuhan၊ China) နှင့် β-actin (Proteintech၊ Wuhan၊ China)။
ယခင်က ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း disuccinimide suberate (DSS) နှင့် အပြန်အလှန်ချိတ်ဆက်ခြင်းကို လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ဆဲလ်များကို အအေးခံ PBS ဖြင့် ၃ ကြိမ် ဆေးကြောပြီး 25 mM Na2PO4၊ 187.5 mM NaCl, 25 mM HEPES နှင့် 125 mM NaHCO3 ပါဝင်သော 50 µl ASC တုံ့ပြန်မှုကြားခံ (pH 8.0) တွင် 27 gauge needle ဖြင့် လုံးလုံးလျားလျား ရောနှောထားသည်။အရောအနှောကို 5000 g တွင် 3 မိနစ်ကြာ အာရုံစူးစိုက်ထားပြီး 10 µl DSS (DMSO တွင် 25 မီလီမီတာ) နှင့် 40 µl ASC တုံ့ပြန်မှုကြားခံဖြင့် ခဲပြားကို 30 မိနစ်ကြာ 37°C တွင် ချုပ်ထားသည်။5000 g တွင် 10 မိနစ်ကြာ centrifugation ပြုလုပ်ပြီးနောက်၊ အမှုန့်ကို ASC တုံ့ပြန်မှုကြားခံကြားခံ 40 µl နှင့် 6x ပရိုတိန်းတင်ကြားခံကြားခံ (TransGen၊ Beijing၊ China) ၏ 10 µl တွင် ပျော်ဝင်ပြီး အဖြေကို အခန်းအပူချိန်တွင် 15 ပတ်ကြာ မီးငြှိမ်းသတ်ခဲ့သည်။ မိထို့နောက် ၁၀ မိနစ်ခန့်ပြုတ်ပါ။ထို့နောက် ပရိုတိန်းနမူနာများကို 1:500 ရှိသော ပရိုတိန်းဆန့်ကျင်သော ပဋိပစ္စည်းများ (Wanleibio, Shenyang, China) ဖြင့် အနောက်တိုင်းမှ ပိတ်ဆို့ခြင်းအား ခံခဲ့ရသည်။
ယခင်က ဖော်ပြထားသည့် လုပ်ထုံးလုပ်နည်း [13] ပြီးနောက်၊ ဆဲလ်ယဉ်ကျေးမှု လွန်ကဲသော အရာများကို ရိတ်သိမ်းပြီး ရောင်ရမ်းမှု လိုလားသော ဆိုက်တိုကီine IL-1β ၏ လျှို့ဝှက်ချက်ကို မောက်စ် IL-1 Beta ELISA ကိရိယာ (Invitrogen၊ Thermo Fisher Scientific) သုံးပြီး ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။IL-1β စံမျဉ်းကွေးကို အသုံးပြု၍ OD450nm တန်ဖိုးများကို ပရိုတင်းပါဝင်မှုအဖြစ်သို့ ပြောင်းပါ။
မျက်နှာဖုံးများပေါ်တွင် ဖုံးအုပ်ထားသော ဆဲလ်များကို ပူနွေးသော PBS တွင် ၃ ကြိမ် ညင်သာစွာ ဆေးကြောပြီး တစ်ရှူးဆဲလ်များကို ပြုပြင်ပေးသော (Biosharp၊ Beijing, China) တွင် အခန်းအပူချိန် (RT) တွင် 10 မိနစ်၊ 0.1% Triton X-Permeabilize 100 တွင် (PBS တွင် အရည်ဖျော်ထားသည်; Biosharp ) အခန်းအပူချိန်မှာ မိနစ် 20 ထားပြီး အခန်းအပူချိန်မှာ 5% bovine serum albumin (PBS) မှာ ပိတ်ဆို့ထားပါ။ထို့နောက် 4°C တွင် ဆဲလ်များကို ASC (1:100 dilution) သို့မဟုတ် NLRP3 (1:100 dilution) အသီးသီးဖြင့် 4°C တွင် ပေါက်ဖွားခဲ့ပြီး၊ နှင့် Cy3 တံဆိပ်တပ်ထားသော ဆိတ်ဆန့်ကျင်ဘက်ယုန် IgG(H+L) (1:400; EarthOx၊ ဆန်ဖရန်စစ္စကို၊ CA၊ USA) သို့မဟုတ် FITC-conjugated goat anti- mouse IgG (1:400; Earthox) သည် 37°C အမှောင်ထဲတွင် ၁ နာရီကြာအောင် ညအိပ်ပါ။နျူကလိယအား Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE၊ Suzhou, China) ဖြင့် ၅ မိနစ်ကြာ စွန်းထင်းခဲ့ပြီး အလင်းအဏုကြည့်မှန်ပြောင်း (Olympus Corporation, Tokyo, Japan) အောက်တွင် စောင့်ကြည့်လေ့လာခဲ့သည်။
ကြွက်များကို အုပ်စုလေးခုခွဲထားသည် (n=7) အုပ်စုတစ်ခုစီတွင်- (i) PBS ကုသထားသော အနုတ်လက္ခဏာထိန်းချုပ်မှုအုပ်စု (PBS သာ; gavage 100 µl/ mouse PBS ပြီးနောက် နေ့စဉ် အတွင်းသားအိမ်တွင်းထိုးဆေး 100 µl/ mouse PBS 3 နာရီကြာပြီးနောက်)။7 ရက်အဆက်မပြတ်;(ii) MCC950 inhibitor [27] (PBS gavage မှတဆင့် 100 µl/ mouse၊ 3 နာရီအကြာတွင်၊ 10 mg/kg body weight [BW] MCC950 [PBS] ကို နေ့စဉ် အတွင်းပိုင်းအတွင်းပိုင်းအရ စီမံအုပ်ချုပ်ခဲ့သည်၊ ကြာချိန် 7 ရက်)(iii) G. duodenalis cyst ပိုးဝင်ခြင်းအုပ်စု (1.5 x 106 cysts/ mouse၊ 3 နာရီကြာပြီးနောက်၊ 100 μl/ mouse PBS intraperitoneally နေ့စဉ် 7 ရက်ကြာ)(iv) G. duodenalis cyst ပေါင်းစပ်ပိုးကူးစက်မှုအုပ်စု MCC950 inhibitor ကုသမှုအုပ်စု (gavage မှတဆင့် 1.5×106 cysts/ mouse၊ 10mg/kg body weight MCC950 intraperitoneally daily 7 days for 3h at 7 days)။ကြွက်တစ်ကောင်ချင်းစီ၏ ကိုယ်အလေးချိန်ကို နေ့စဉ်စစ်ဆေးပြီး 7 ရက်မြောက်နေ့တွင် ကြွက်အားလုံးကို သတ်ပစ်ခဲ့သည်။ရိတ်သိမ်းထားသော duodenum (အရှည် 3 စင်တီမီတာ) ကို 1 ml PBS တွင် အတုံးသေးသေးလေးများဖြစ်အောင် လှီးဖြတ်ပြီး 4°C တွင် PBS တွင် cysts နှင့် G. duodenalis trophozoites တို့ကို ညတွင်းချင်း ဖျက်ဆီးခဲ့ပါသည်။လတ်ဆတ်သော duodenum (1 စင်တီမီတာရှည်) ကို hematoxylin နှင့် eosin (H&E) စွန်းထင်းမှုအတွက် သီးခြားခွဲထားသည်။
ကြွက်များကို အုပ်စုနှစ်စုခွဲထားသည်- (၁) MOCK ထိန်းချုပ်မှုအုပ်စုနှင့် (ii) MCC950 inhibitor အုပ်စု။အုပ်စုတစ်ခုစီတွင် ကုသမှုငါးခုရှိပါသည် (n = 7/treatment group): (i) PBS ကုသမှုအနုတ်လက္ခဏာထိန်းချုပ်မှုအုပ်စု (PBS only; 100 µl/ mouse PBS၊ ကြွက်သား (IM) ထိုးခြင်း (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1(+) plasmid အနုတ်လက္ခဏာထိန်းချုပ်မှုအုပ်စု (100 µg/ mouse DNA၊ ကြွက်သားထိုးဆေးမှတဆင့်) (iii) G. duodenalis cyst ရောဂါပိုးကူးစက်မှုအပြုသဘောဆောင်သောထိန်းချုပ်မှုအုပ်စု (1.5 x 106 cysts/ mouse၊ gavage မှတဆင့်) (iv) a plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-2 (100 μg/ mouse DNA၊ ကြွက်သားထိုးဆေး) ဖြင့် ကုသထားသော အုပ်စုနှင့် (v) plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (100 µg/ mouse) ဖြင့် ကုသထားသော အုပ်စု DNA ကို 12 နာရီကြာဖြတ်သန်းပြီးနောက် MCC950 inhibitor အုပ်စုရှိ ကြွက်များသည် MCC950 (ခန္ဓာကိုယ်အလေးချိန် 10 mg/kg) ကို 7 ရက်ကြာနေ့စဉ် အတွင်းသားတွင်းထိုးဆေးကို လက်ခံရရှိပြီး MOCK အုပ်စုရှိ ကြွက်များတွင် PBS ပမာဏ တူညီသော PBS ကုသမှုကို ရရှိခဲ့ပါသည်။ သွေးနမူနာများ ကြွက်များထံမှ စုဆောင်းပြီး 4°C တွင် တစ်ညလုံး ထားခဲ့သော သွေးရည်ကြည်နမူနာများကို အင်ဇိုင်းဖြင့်ချိတ်ဆက်ထားသော ခုခံအားစုပ်ယူမှုဆိုင်ရာ စစ်ဆေးမှု (ELISA) နှင့် IL-1β အဆင့်များကို တိုင်းတာခြင်းတို့ကို အသုံးပြု၍ သီးခြားခွဲထုတ်ခဲ့သည်။
ကြွက်သုံးဆယ့်ငါးကောင်ကို အုပ်စုငါးစု (n=7/အုပ်စု) ခွဲထားသည်။အုပ်စု 1 သည် PBS ဖြင့် ကုသထားသော အနုတ်လက္ခဏာ ထိန်းချုပ်အုပ်စုဖြစ်သည်- ကြွက်များသည် PBS 100 μl ကို အကြောသွင်းပြီး 3 ရက်အကြာတွင် တိုင်းတာသည်။အုပ်စု 2 သည် G. duodenalis cysts ကူးစက်ခံထားရသော အပြုသဘောဆောင်သည့် ထိန်းချုပ်အုပ်စုဖြစ်သည်- ကြွက်များကို PBS 100 μl ဖြင့် ထိုးသွင်းခဲ့ပြီး 3 ရက်အကြာတွင် 1.5 x 106 cysts/ mouse ကို ပါးစပ်ဖြင့် ထိုးသွင်းခဲ့သည်။တတိယအုပ်စု - pcDNA3.1(+) ဖြင့် plasmid ကာကွယ်ဆေးထိုးခြင်းသည် duodenal cyst ပိုးဝင်ခြင်းအတွက် ထိန်းချုပ်သည့်အုပ်စုနှင့် ပေါင်းစပ်ခြင်း- ကြွက်များသည် plasmid DNA pcDNA3.1(+)(im) ပါးစပ်ဖြင့် 100 μg၊ 1.5×106 cysts/ mouse 3 အများအပြားအတွက်၊ နေ့ရက်များ။အုပ်စု 4 နှင့် 5 တို့သည် G. duodenalis cyst ပိုးဝင်ခြင်းနှင့် ပေါင်းစပ်ထားသော အုပ်စု 4 နှင့် 5 တို့သည် ပြန်လည်ပေါင်းစပ်ထားသော pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine plasmid သို့မဟုတ် pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine plasmid တို့ဖြစ်သည်။စမ်းသပ်အုပ်စု- ကြွက်များ 100 µg pcDNA3 ကို လက်ခံရရှိသည် ။1(+)-giardine plasmid DNA (im) ထို့နောက် 3 ရက်အကြာတွင် 1.5 × 106 cysts/ mouse ကို gavage မှတစ်ဆင့် ထိုးသွင်းခဲ့သည်။G. duodenalis cyst ကို ပြွန်မှတဆင့် သွင်းပြီးနောက် ကြွက်တစ်ခုစီ၏ ခန္ဓာကိုယ်အလေးချိန်ကို စောင့်ကြည့်ခဲ့သည်။လတ်ဆတ်သော duodenum ကို ကပ်ပါးဝန်တိုင်းတာခြင်းနှင့် HE စွန်းထင်းခြင်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းအတွက် စုဆောင်းခဲ့သည်။
ယခင်က ထုတ်ပြန်ထားသော လုပ်ထုံးလုပ်နည်း [30] အရ Histopathological ပြောင်းလဲမှုများကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။လတ်ဆတ်သော duodenum ကို တစ်သျှူးဆဲလ် fixative ဖြင့် ပါရာဖင်တွင် မြှုပ်နှံထားပြီး၊ 4 μm အပိုင်းများ ဖြတ်ကာ H&E ဖြင့် စွန်းထင်းကာ အလင်းအဏုကြည့်မှန်ဘီလူးအောက်တွင် ပိုင်းခြားစိတ်ဖြာထားသည်။အမှီအခိုကင်းသော ကြွက် ခုနစ်ခုမှ တစ်သျှူးအပိုင်း ခုနစ်ခုရှိ ရောဂါဗေဒဆိုင်ရာပြောင်းလဲမှုများကို ကိုယ်စားပြုသည့် ကုသမှုကို သတိမထားမိဘဲ ရောဂါဗေဒပညာရှင်မှ အကဲဖြတ်ခဲ့ပြီး 200x ချဲ့ထွင်မှုဖြင့် ဖမ်းယူခဲ့သည်။villi ၏အရှည်နှင့် crypts များ၏အတိမ်အနက်ကိုယခင်ဖော်ပြထားသောနည်းလမ်းများနှင့်အညီတိုင်းတာခဲ့သည်။
vitro နှင့် vivo ရလဒ်များကို triplicate ဖြင့်ရရှိခဲ့သည်။GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) ကို အသုံးပြု၍ ဂရပ်ဖစ်များကို ထုတ်လုပ်ခဲ့သည်။အုပ်စုနှစ်စုကြားရှိ ကွာခြားချက်များကို t-test ဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာပြီး ≥3 အုပ်စုကြား ကွဲပြားမှုများကို SPSS ဆော့ဖ်ဝဲလ် (ဗားရှင်း 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA) အသုံးပြု၍ တစ်လမ်းသွားခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု (ANOVA) ဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ဒေတာကို Levene ၏စမ်းသပ်မှုကို အသုံးပြု၍ ကွဲလွဲမှု၏ တစ်သားတည်းဖြစ်မှုကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာပြီး Bonferroni ၏ post hoc test (B) ဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာသည်။သိသာထင်ရှားမှုကို P<0.05၊ P<0.01 နှင့် P<0.001 (မထူးခြားသော [ns]) (P>0.05) အဖြစ် ဖော်ပြသည်။
ကျိုတိုစွယ်စုံကျမ်း၏ Genes and Genomes (KEGG) ရှိ GEV proteomics ဆိုင်ရာ ကျွန်ုပ်တို့၏ယခင်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုတွင် ပစ်မှတ်များစွာသည် ရောင်ရမ်းမှုအချက်ပြလမ်းကြောင်းများကို အသက်သွင်းခြင်းတွင် ပါဝင်နိုင်သည် [13] ကိုပြသခဲ့သည်။ကျွန်ုပ်တို့သည် အလားအလာရှိသောပစ်မှတ်နှစ်ခုဖြစ်သည့် alpha-2 နှင့် alpha-7.3 giardins ကိုရွေးချယ်ပြီး ဤမော်လီကျူးများကို ချဲ့ထွင်ကာ pcDNA3.1(+) eukaryotic expression vector ကိုတည်ဆောက်ရန်အတွက် ၎င်းတို့ကိုအသုံးပြုပါသည်။စီစစ်ပြီးနောက်၊ ပြန်လည်ပေါင်းစပ်ထားသော pcDNA3.1(+)-alpha-2 နှင့် alpha-7.3 giardine expression plasmids များကို မူလ mouse peritoneal macrophages အဖြစ်သို့ ကူးစက်သွားပြီး ရောင်ရမ်းခြင်း၏ caspase-1 p20 signature protein (activated caspase-1 အပိုင်းအစ) ကို ဖော်ထုတ်ခဲ့သည်။ ရောင်ရမ်းမှုကို ဖြစ်စေနိုင်သော အဓိက မော်လီကျူးများကို ရှင်းလင်းဖော်ပြခြင်း ဖြစ်သည်။ရလဒ်များက alpha-2 နှင့် alpha-7.3 giardines သည် GEV နှင့်ဆင်တူသော p20 caspase-1 စကားရပ်ကို လှုံ့ဆော်ပေးနိုင်ကြောင်း ပြသခဲ့သည်။မကုသရသေးသော အနုတ်လက္ခဏာထိန်းချုပ်မှု (PBS only) နှင့် plasmid ထိန်းချုပ်မှု pcDNA3.1(+) (ပုံ 1) တွင် caspase-1 အသက်သွင်းခြင်းအပေါ် သက်ရောက်မှုမရှိပါ။
pcDNA3.1(+)-alpha-2 နှင့် alpha-7.3 giardins ဖြင့် p20 caspase-1 အသက်သွင်းခြင်းကို တိုင်းတာခြင်း။ပြန်လည်ပေါင်းစည်းထားသော eukaryotic expression plasmids pcDNA3.1(+)-alpha-2 နှင့် alpha-7.3 giardines (လမ်းကြောင်းတစ်ခုစီ၏အထက်) ကို မူလ mouse peritoneal macrophages အဖြစ်သို့ ကူးစက်သွားပြီး 24 နာရီအကြာတွင် ယဉ်ကျေးမှု supernatant များကို ရိတ်သိမ်းခဲ့သည်။Western blotting ကို signature caspase-1 p20 inflammasome ပရိုတင်း၏ဖော်ပြမှုအဆင့်ကိုတိုင်းတာရန်အသုံးပြုခဲ့သည်။PBS သီးသန့်ကုသမှုအုပ်စု (လမ်းသွား C) နှင့် pcDNA3.1(+) မိုနိုကုထုံးအုပ်စု (pcDNA3.1 လမ်းကြား) ကို အနုတ်လက္ခဏာထိန်းချုပ်မှုအဖြစ် အသုံးပြုခဲ့ပြီး GEV ကုသမှုအုပ်စုကို အပြုသဘောဆောင်သောထိန်းချုပ်မှုအဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည်။ပရိုတိန်းတစ်ခုစီရှိ histidine တက်ဂ်ကို ထောက်လှမ်းခြင်းဖြင့် ပြန်လည်ပေါင်းစပ်ထားသော ပရိုတင်း၏ဖော်ပြမှုကို အတည်ပြုခဲ့ပြီး မျှော်လင့်ထားသည့်ပရိုတိန်းကြိုးများမှာ alpha-2 giardine (38.2 kDa) နှင့် alpha-7.3 giardine (37.2 kDa) ဖြစ်သည်။GEV၊ Giardia duodenum extracellular vesicles၊ pcDNA3.1(+)၊ EcoRV-linearized vector၊ SUP၊ supernatant
alpha-2 giardine နှင့် alpha-7.3 giardine သည် p20 caspase-1 ထုတ်ဖော်ပြောဆိုမှုကို ဖြစ်ပေါ်စေပြီး အိမ်ရှင် NLRP3 ရောင်ရမ်းမှုတုံ့ပြန်မှုကို အသက်ဝင်စေခြင်း ရှိ၊ မရှိ ဆုံးဖြတ်ရန်၊ pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine နှင့် pcDNA3.1(+)-alpha -7.3 giardin အား ပြန်လည်ပေါင်းစပ်ထားသော ပလာစမစ် DNA ပါရှိသော မူလ mouse peritoneal macrophages အဖြစ်သို့ ကူးစက်သွားပြီး အဓိက ရောင်ရမ်းနေသော ပရိုတင်း NLRP3 ၏ အဆင့်များ၊ နယ်မြေသတ်မှတ်ခြင်းနှင့် oligomerization တို့ကို ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ဤစမ်းသပ်ချက်တွင် GEV ကို အပြုသဘောဆောင်သော ထိန်းချုပ်မှုအုပ်စုအဖြစ် အသုံးပြုခဲ့ပြီး ကုသရေးအုပ်စုမရှိ (PBS သာ) သို့မဟုတ် pcDNA3.1(+) ကူးပြောင်းကုသရေးအုပ်စုသည် အနုတ်လက္ခဏာအုပ်စုဖြစ်သည်။ရလဒ်များက GEV အုပ်စုတွင်ကဲ့သို့ giardin pcDNA3.1(+)-alpha-2 နှင့် giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 ၏ ပြန်လည်ပေါင်းစပ်ထားသော plasmid DNA သည် NLRP3၊ pro-IL-1β နှင့် procaspase-1 နှင့် caspase-1 အသက်သွင်းခြင်း (ပုံ။ 2a)။ထို့အပြင်၊ giardines နှစ်ခုလုံးသည် သိသာထင်ရှားသော IL-1β လျှို့ဝှက်ချက် (pcDNA3.1: ANOVA၊ F(4, 10) = 1.625၊ P = 0.1000; alpha-2 giardine: ANOVA၊ F(4, 10) = 1.625၊ P = 0.0007၊ );alpha-7.3 giardine- ANOVA၊ F(4၊ 10) = 1.625၊ P<0.0001;GEV- ANOVA၊ F(4၊ 10) = 1.625၊ P = 0.0047) (ပုံ 2b)။ASC ပရိုတိန်းအများစုသည် ကုသခြင်းမပြုသောအုပ်စုတွင် သို့မဟုတ် pcDNA3.1(+) plasmid ဖြင့်ကူးစက်သောကုသမှုအုပ်စုတွင် monomeric ဖြစ်ကြသည်၊၊ pcDNA3.1(+)-alpha-2 သို့မဟုတ် pcDNA3.1(+)-alpha- နှင့်မတူဘဲ၊ 7.3 giardine ။ASC oligomerization သည် oligomeric ပုံစံ (ပုံ 2c) ကိုပြသသည့် GEV အပြုသဘောဆောင်သော ထိန်းချုပ်မှုအုပ်စု သို့မဟုတ် အုပ်စု၏ ပြန်လည်ပေါင်းစပ်ထားသော ပလတ်စမစ် DNA တွင် ဖြစ်ပေါ်သည်။ဤပဏာမအချက်အလက်များအရ alpha-2 giardine နှင့် alpha-7,3 giardine သည် NLRP3 ရောင်ရမ်းမှုကို လှုံ့ဆော်ပေးသည်ဟု အကြံပြုထားသည်။ASC နှင့် NLRP3 ၏ဒေသခံအဖြစ်ပြောင်းလဲခြင်း၏နောက်ဆက်တွဲ immunofluorescent လေ့လာမှုများက အနုတ်လက္ခဏာထိန်းချုပ်မှုအုပ်စုတွင် ASC ပရိုတင်းသည် cytoplasm တစ်လျှောက်တွင် ပြန့်ကျဲနေပြီး pcDNA3.1(+)-alpha-2 နှင့် giardine သို့မဟုတ် pcDNA3 တို့ကို လှုံ့ဆော်သောအခါ အစက်အချက်ပြမှုအဖြစ် ပေါ်လာကြောင်းပြသခဲ့သည်။1(+)-alpha-7,3 giardine အုပ်စု သို့မဟုတ် GEV အပြုသဘောဆောင်သော ထိန်းချုပ်မှုအုပ်စု (ပုံ 2d)။အနုတ်လက္ခဏာထိန်းချုပ်မှုနှင့် ပလာစမစ်-ကုသသော pcDNA 3.1 အုပ်စုများတွင်၊ NLRP3 ပရိုတင်းအချက်ပြမှုကို မတွေ့ရှိရဘဲ pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine သို့မဟုတ် pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 ကို တုံ့ပြန်သည့် fluorescent အချက်ပြအစက်တစ်ခု စစ်ဆေးတွေ့ရှိခဲ့သည်။.giardine ကို cytoplasm တွင် သို့မဟုတ် HEV (ပုံ 2e) ၏ လှုံ့ဆော်မှုတွင် တွေ့ရှိရသည်။ဤအချက်အလက်များသည် G. duodenalis giardin alpha-2 နှင့် giardin alpha-7.3 သည် mouse primary peritoneal macrophages တွင် NLRP3 inflammasome ကို အသက်သွင်းကြောင်း ထပ်လောင်းပြသသည်။
pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin နှင့် pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin တို့သည် mouse peritoneal macrophages တွင် NLRP3 ရောင်ရမ်းမှုကို အသက်သွင်းသည်။ပြန်လည်ပေါင်းစည်းထားသော eukaryotic expression ကို plasmids pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin နှင့် pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin အား ပင်မ murine peritoneal macrophages နှင့် ဆဲလ်များအဖြစ်သို့ ကူးပြောင်းခြင်း၊ သို့မဟုတ် ထုတ်ဖော်ပြောဆိုမှုအား ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန်အတွက် 24 နာရီအတွင်း supernatant ကို ရိတ်သိမ်းခြင်း၊ , လျှို့ဝှက်ချက်။နှင့် အဓိက ရောင်ရမ်းသော ပရိုတင်းများ၏ နေရာယူမှု။PBS-only (C) အုပ်စုနှင့် pcDNA3.1(+) တစ်ခုတည်းသော ကုသမှုအုပ်စုကို အနုတ်လက္ခဏာထိန်းချုပ်မှုအဖြစ် အသုံးပြုခဲ့ပြီး GEV ကုသမှုအုပ်စုကို အပြုသဘောဆောင်သောအုပ်စုအဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည်။NLRP3၊ pro-IL-1β၊ pro-caspase-1 နှင့် p20 caspase-1 အပါအဝင် အဓိက ရောင်ရမ်းသော ပရိုတင်း NLRP3 ကို အနောက်တိုင်း လိမ်းဆေးဖြင့် ရှာဖွေတွေ့ရှိခဲ့သည်။b supernatants များတွင် IL-1β ၏ လျှို့ဝှက်ချက်အဆင့်များကို အင်ဇိုင်းချိတ်ဆက်ထားသော ခုခံအားစုပ်ယူမှု စစ်ဆေးမှု (ELISA) ကို အသုံးပြု၍ ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။SPSS ဆော့ဖ်ဝဲဗားရှင်း 22.0 ကို အသုံးပြု၍ ထိန်းချုပ်မှုနှင့် စမ်းသပ်အုပ်စုများအကြား ကွာခြားချက်များကို တစ်လမ်းသွားခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု (ANOVA) ဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ကြယ်ပွင့်များသည် **P<0.01 နှင့် ***P<0.001 အုပ်စုများကြား သိသာထင်ရှားသော ကွာခြားချက်များကို ဖော်ပြသည်။c အစေ့များရှိ ASC oligomerization အဆင့်များကို DSS ချိတ်ဆက်ခြင်းဆိုင်ရာ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုဖြင့် ဆုံးဖြတ်ပြီး ဆဲလ် lysates ရှိ ASC အဆင့်များကို loading ထိန်းချုပ်မှုအဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည်။d immunofluorescence ကို အသုံးပြု၍ ISC ဒေသထွက်ခြင်းကို ပုံဖော်ခြင်း။e Immunofluorescence ကို NLRP3 ၏ ဒေသအလိုက် ပြောင်းလဲမှုကို မြင်သာစေရန် အသုံးပြုခဲ့သည်။ASC၊ apoptotic speck-like protein၊IL၊ interleukin;NLRP3၊ nucleotide-binding oligomerization-like receptor 3;ns၊ သိသိသာသာမဟုတ်ပါ (P > 0.05)
G. duodenalis နှင့် ၎င်း၏လျှို့ဝှက်ချက် GEV နှစ်ခုလုံးသည် NLRP3 ရောင်ရမ်းမှုကို အသက်သွင်းပြီး vitro တွင် လက်ခံဆောင်ရွက်ပေးသော ရောင်ရမ်းမှုတုံ့ပြန်မှုများကို ထိန်းညှိပေးသည်။ထို့ကြောင့်၊ G. duodenalis ၏ရောဂါဖြစ်ပွားမှုတွင် NLRP3 ရောင်ရမ်းခြင်း၏အခန်းကဏ္ဍသည်မရှင်းလင်းပါ။ဤပြဿနာကိုစုံစမ်းရန်၊ G. duodenalis cyst နှင့် G. duodenalis cyst + MCC950 inhibitor ကုသမှုကိုကူးစက်သောကြွက်များနှင့် G. duodenalis cyst ပိုးကူးစက်ခံရသောအခါ NLRP3 ရောင်ရမ်းခြင်းဖော်ပြချက်တို့ကို နှိုင်းယှဉ်ကာ ဤပြဿနာကိုစုံစမ်းစစ်ဆေးရန် ကျွန်ုပ်တို့ ဒီဇိုင်းထုတ်ထားပါသည်။စမ်းသပ်မှု၏အသေးစိတ်အစီအစဉ်ကို ပုံ 3a တွင်ပြသထားသည်။ကွဲပြားသောကုသမှုအုပ်စုများရှိ ကြွက်များ၏ခန္ဓာကိုယ်အလေးချိန်ပြောင်းလဲမှုများကို cysts ပိုးကူးစက်ပြီးနောက် 7 ရက်ကြာစောင့်ကြည့်ခဲ့ပြီးရလဒ်များကိုပုံ 3b တွင်ပြသထားသည်။သန့်စင်သော PBS ဖြင့် ကုသသည့်အုပ်စုနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ရလဒ်များက (i) G. duodenalis cyst ကူးစက်ခံရသော ကြွက်များ၏ ခန္ဓာကိုယ်အလေးချိန်သည် ရောဂါပိုးကူးစက်ပြီးနောက် နေ့ 3 ရက်မှ 7 ရက်အထိ လျော့ကျသွားကြောင်း၊(ii) MCC950 inhibitor ဖြင့် ကုသခြင်းသည် ကြွက်များ၏ ခန္ဓာကိုယ်အလေးချိန်အပေါ် သိသာထင်ရှားသော သက်ရောက်မှုမရှိပါ။.တစ်ခုတည်းသောကူးစက်မှုအုပ်စုနှင့်နှိုင်းယှဉ်ပါက MCC950 ဖြင့်ကုသသော duodenal ရောဂါပိုးအုပ်စု၏ BW သည်ကွဲပြားသောဒီဂရီသို့ကျဆင်းသွားသည် (နေ့ 1: ANOVA, F(3, 24) = 1.885, P = 0.0148; Day 2: ANOVA, F(3, 24) ) = 0.4602, P<0.0001; နေ့ 3: ANOVA, F(3, 24) = 0.8360, P = 0.0010; နေ့ 4: ANOVA, F(3, 24) = 1.683, P = 0.0052, Day 5: A (3၊ 24)=0.6497၊ P=0.0645; နေ့ 6- ANOVA, F(3, 24)=5.457, P=0.0175; နေ့ 7- ANOVA, F(3, 24) = 2.893, P = 0.0202)။ဤအချက်အလက်များသည် NLRP3 ရောင်ရမ်းခြင်းမှ ကြွက်များကို duodenal ပိုးဝင်ခြင်း၏အစောပိုင်းအဆင့် (2-4 ရက်) တွင်သိသိသာသာကိုယ်အလေးချိန်ကျခြင်းမှကာကွယ်ပေးကြောင်းပြသသည်။ထို့နောက် ကျွန်ုပ်တို့သည် duodenal lavage အရည်တွင် G. duodenalis trophozoites ကိုရှာဖွေရန် ရည်ရွယ်ပြီး ရလဒ်များကို ပုံ 3c တွင်ပြသထားသည်။G. duodenalis cyst ပိုးဝင်သောအုပ်စုနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက NLRP3 inflammasome (t(12) = 2.902, P = 0.0133) ကို ပိတ်ဆို့ပြီးနောက် duodenum ရှိ trophozoites အရေအတွက် သိသိသာသာ တိုးလာသည်။HE ဖြင့် စွန်းထင်းနေသော Duodenal တစ်ရှူးများကို PBS နှင့် MCC950 တစ်ခုတည်းဖြင့် ကုသသော အနုတ်လက္ခဏာဆောင်သော ထိန်းချုပ်မှုများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပြသခဲ့သည်- (i) G. duodenalis cyst ပိုးဝင်ခြင်းကြောင့် duodenal villi (ANOVA၊ F(3, 24)=0.4903၊ P= 0.0488၊ ) နှင့် crypt atrophy (ANOVA, F(3, 24) = 0.4716, P = 0.0089);(ii) G. duodenalis cysts ရောဂါပိုးရှိသောကြွက်များမှ duodenum နှင့် MCC950 inhibitors ဖြင့်ကုသခြင်း။duodenal villi ပျက်စီးပြီးသေဆုံးသွားသည် (ANOVA၊ F(3၊ 24) = 0.4903၊ P = 0.0144) ဖောင်းလာပြီး လျှို့ဝှက်အကိုင်းအခက် (ANOVA၊ F(3၊ 24) = 0.4716၊ P = 0, 0481) (ပုံ။ 3d- f)ဤရလဒ်များအရ NLRP3 ရောင်ရမ်းမှုသည် G. duodenalis ၏ရောဂါဖြစ်ပွားမှုကိုလျှော့ချရန်အတွက်အခန်းကဏ္ဍတစ်ခုမှလုပ်ဆောင်ကြောင်းဖော်ပြသည်။
Giardia duodenum ကူးစက်မှုတွင် NLRP3 ရောင်ရမ်းခြင်း၏အခန်းကဏ္ဍ။ကြွက်များကို (iv) duodenococcal cysts ဖြင့် ကုသပြီးနောက် MCC950 (ip) ဖြင့် သို့မဟုတ် မပါဘဲ ကုသခဲ့သည်။PBS သို့မဟုတ် MCC950 ရှိသော တစ်ခုတည်းသော ကုသမှုအုပ်စုများကို ထိန်းချုပ်မှုများအဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည်။စမ်းသပ်အုပ်စုနှင့် ကုသနည်း။b ကုသမှုအုပ်စုတစ်ခုစီတွင် ကြွက်များ၏ ခန္ဓာကိုယ်အလေးချိန်ကို 7 ရက်ကြာ စောင့်ကြည့်ခဲ့သည်။G. duodenalis ရောဂါကူးစက်မှုအုပ်စုနှင့် G. duodenalis + MCC950 ရောဂါပိုးကုသမှုအုပ်စုအကြား ခြားနားချက်ကို SPSS ဆော့ဖ်ဝဲဗားရှင်း 22.0 ကို အသုံးပြု၍ t-test ဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ကြယ်ပွင့်များသည် *P<0.05၊ **P<0.01 သို့မဟုတ် ***P<0.001 တွင် သိသာထင်ရှားသော ခြားနားချက်များကို ဖော်ပြသည်။c Parasitic load ကို duodenal lavage fluid တွင် trophozoites အရေအတွက်ကိုရေတွက်ခြင်းဖြင့် ဆုံးဖြတ်သည်။G. duodenalis ရောဂါကူးစက်မှုအုပ်စုနှင့် G. duodenalis + MCC950 ရောဂါပိုးကုသမှုအုပ်စုအကြား ခြားနားချက်ကို SPSS ဆော့ဖ်ဝဲဗားရှင်း 22.0 ကို အသုံးပြု၍ t-test ဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ကြယ်ပွင့်များသည် *P < 0.05 တွင် သိသာထင်ရှားသော ခြားနားချက်များကို ဖော်ပြသည်။d Hematoxylin နှင့် eosin (H&E) စွန်းထင်းခြင်းသည် duodenal histopathology ၏ရလဒ်များ။အနီရောင်မြှားများသည် villi ၏ပျက်စီးမှုကိုဖော်ပြသည်၊ အစိမ်းရောင်မြှားများသည် crypt များပျက်စီးမှုကိုဖော်ပြသည်။စကေးဘား- 100 µm။ငကြယ်ပွင့်များသည် *P<0.05 နှင့် **P<0.01 တွင် သိသာထင်ရှားသော ခြားနားချက်များကို ဖော်ပြသည်။ရလဒ်များကို လွတ်လပ်သောဇီဝစမ်းသပ်မှု 7 ခုမှရယူသည်။BW, ခန္ဓာကိုယ်အလေးချိန်;ig၊ ရင်သပ်ရှုမောဖွယ် ပေးပို့မှုလမ်းကြောင်း၊ip၊ အတွင်းသားအိမ်တွင်း ပို့ဆောင်မှုလမ်းကြောင်း၊ns၊ သိသိသာသာမဟုတ်ပါ (P > 0.05);PBS၊ ဖော့စဖိတ် ဆားရည်၊WT၊ အရိုင်းအမျိုးအစား
IL-1β ၏လျှို့ဝှက်ချက်သည် ရောင်ရမ်းခြင်း၏ လက္ခဏာတစ်ခုဖြစ်သည်။G. duodenalis alpha-2 giardine နှင့် alpha-7.3 giardine တို့သည် vivo တွင် NLRP3 host inflammasome ကို အသက်သွင်းခြင်း ရှိ၊ မရှိ ဆုံးဖြတ်ရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် မကုသရသေးသော WT ကြွက်များ (အတုအယောင်အုပ်စု) နှင့် NLRP3 ရောင်ရမ်းခြင်း-ပိတ်ဆို့ထားသော ကြွက်များ (MCC950 တားမြစ်ထားသော ကုသရေးအုပ်စု) ကို အသုံးပြုထားပါသည်။စမ်းသပ်မှု၏အသေးစိတ်အစီအစဉ်ကို ပုံ 4a တွင်ပြသထားသည်။စမ်းသပ်အုပ်စုများတွင် PBS၊ G. duodenalis cyst ကုသမှု၊ pcDNA3.1 ၏အကြောသွင်းဆေးနှင့် pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine သို့မဟုတ် pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine ၏အကြောသွင်းဆေးတို့ ပါဝင်ပါသည်။recombinant plasmid ကို အကြောသွင်းပြီးနောက် 7 ရက်မြောက်နေ့တွင်၊ သွေးရည်ကြည်ကို စုဆောင်းပြီး အုပ်စုတစ်ခုစီရှိ IL-1β အဆင့်ကို ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ပုံ 4b တွင်ပြထားသည့်အတိုင်း၊ MOCK အုပ်စုတွင်- (i) PBS အုပ်စုနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက pcDNA3.1 ကုသမှုသည် IL-1β လျှို့ဝှက်ချက် (ANOVA၊ F(4.29)=4.062၊ P=0.9998) အပေါ် သိသာထင်ရှားသောအကျိုးသက်ရောက်မှုမရှိပါ။ G. duodenalis cyst အုပ်စု (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine နှင့် pcDNA3 တွင် IL-β လျှို့ဝှက်ချက် သိသိသာသာ မြင့်တက်လာသည်။1- alpha-7.3 giardine ၏အကြောသွင်းဆေးသည် သွေးရည်ကြည် IL-1β အဆင့် (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P<0.0001);(iii) pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine သည် pcDNA3.1-alpha-2 giardine ကြွက်သားထိုးဆေးအုပ်စုတွင် IL -1β လျှို့ဝှက်ချက်မြင့်မားမှုကို လှုံ့ဆော်ပေးသည် (ANOVA၊ F(4, 29) = 4.062၊ P = 0.0333) .MCC950 ကုသမှုအုပ်စုနှင့် MOCK အုပ်စုရှိ အုပ်စုတစ်ခုစီနှင့် နှိုင်းယှဉ်ထားသည်- (i) PBS ထိန်းချုပ်မှုအုပ်စုရှိ IL-1β လျှို့ဝှက်ချက်အဆင့်နှင့် pcDNA3.1 ထိန်းချုပ်မှုအုပ်စုသည် MCC950 inhibitor ကိုပိတ်ဆို့ပြီးနောက် အတိုင်းအတာတစ်ခုအထိ ကျဆင်းသွားသော်လည်း ကွာခြားချက်မရှိပေ။ ထူးခြားချက် (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.5949);(ii) MCC950 ကို ပိတ်ဆို့ပြီးနောက်။G. duodenalis cyst-infected အုပ်စု၊ pcDNA3.1-alpha-2 giardine အုပ်စု၊ နှင့် pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine အုပ်စု (G. duodenalis- ANOVA၊ F(9) တွင် IL-1β လျှို့ဝှက်ချက် သိသိသာသာ လျော့ကျသွားသည် , 58) = 3.540 , P = 0.0120; pcDNA3.1-alpha-2 giardine- ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.0447; ) = 3.540, P = 0.0164) ။ဤရလဒ်များက alpha-2 giardine နှင့် alpha-7.3 giardine သည် vivo တွင် NLRP3 ရောင်ရမ်းမှုကို ဖျန်ဖြေပေးကြောင်း အကြံပြုထားသည်။
pcDNA3.1(+)-giardines သည် NLRP3 host inflammasome ကို vivo တွင် အသက်သွင်းသည်။ကြွက်များကို ပြန်လည်ပေါင်းစပ် eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine သို့မဟုတ် pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine ဖြင့် ကာကွယ်ဆေးထိုးထားပြီး MCC950 (ip; MCC950 group) ဖြင့် ကုသခြင်း သို့မဟုတ် မပြုလုပ်ပါ (dummy group )PBS သို့မဟုတ် pcDNA3.1(+) plasmid ကုသမှုအုပ်စုအား အနုတ်လက္ခဏာထိန်းချုပ်မှုအဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည်၊ G. duodenalis cyst ကုသမှုအုပ်စုကို အပြုသဘောဆောင်သောထိန်းချုပ်မှုအဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည်။စမ်းသပ်အုပ်စုနှင့် ကုသနည်း။b ကြွက်များတွင် IL-1β ၏ သွေးရည်ကြည်အဆင့်ကို ELISA စစ်ဆေးမှုဖြင့် ရက် 7 တွင် တိုင်းတာခဲ့သည်။MOCK အုပ်စုရှိ အုပ်စုများကြား ကွာခြားချက်များကို တစ်လမ်းသွား ANOVA သုံးပြီး ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာပြီး MOCK အဖွဲ့နှင့် MCC950 အဖွဲ့ကြား ခြားနားချက်များကို SPSS ဆော့ဖ်ဝဲဗားရှင်း 22.0 ၏ t-test ကို အသုံးပြု၍ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ကြယ်ပွင့်များသည် MOCK အုပ်စုရှိ ကုသမှုအုပ်စုများ၊ *P<0.05 နှင့် ***P<0.001;ဒေါ်လာ ဆိုင်းဘုတ်များ ($) သည် MOCK အုပ်စုရှိ အုပ်စုတစ်ခုစီနှင့် P<0.05 ရှိ MCC950 အုပ်စုကြား သိသာထင်ရှားသော ကွဲပြားမှုများကို ဖော်ပြသည်။လွတ်လပ်သောဇီဝစမ်းသပ်မှု ခုနစ်ခု၏ရလဒ်များ။i၊ ကြွက်သားထိုးဆေး၊ ns၊ သိသိသာသာမဟုတ်ပါ (P > 0.05)
G. duodenalis ကူးစက်မှုတွင် alpha-2 နှင့် alpha-7.3 giardine-mediated activation ၏အကျိုးသက်ရောက်မှုကိုစုံစမ်းစစ်ဆေးရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် WT C57BL/6 ကြွက်များကိုအသုံးပြုပြီး alpha-2 giardine နှင့် alpha-7.3 giardine ထိုးသွင်းပါသည်။G. duodenalis cyst ၏ အစာအိမ်ပြွန်မှတဆင့် ၃ ရက်အကြာတွင် ပလတ်စမစ်ကို ကြွက်သားဖြင့် ထိုးသွင်းခဲ့ပြီး၊ ထို့နောက်တွင် ကြွက်များကို ၇ ရက်ကြာ စောင့်ကြည့်ခဲ့သည်။စမ်းသပ်မှု၏အသေးစိတ်အစီအစဉ်ကို ပုံ 5a တွင်ပြသထားသည်။ကြွက်တစ်ကောင်ချင်းစီ၏ ခန္ဓာကိုယ်အလေးချိန်ကို နေ့စဉ်တိုင်းတာပြီး၊ အစာအိမ်ပြွန်မှတဆင့် အုပ်ချုပ်ပြီးနောက် 7 ရက်မြောက်နေ့တွင် လတ်ဆတ်သော duodenal တစ်ရှူးနမူနာများကို စုဆောင်းကာ trophozoites အရေအတွက်ကို တိုင်းတာပြီး histopathological ပြောင်းလဲမှုများကို လေ့လာတွေ့ရှိခဲ့သည်။ပုံ 5b တွင်ပြထားသည့်အတိုင်း အစာကျွေးချိန်တိုးလာသည်နှင့်အမျှ အုပ်စုတစ်ခုစီရှိ ကြွက်များ၏ BW သည် တဖြည်းဖြည်းတိုးလာသည်။G. duodenalis cysts ၏ intragastric စီမံအုပ်ချုပ်ပြီးနောက် 3 ရက်မြောက်နေ့တွင် ကြွက်များ၏ MT သည် လျော့နည်းလာပြီး တဖြည်းဖြည်း တိုးလာသည်။alpha-2 giardine နှင့် alpha7.3 giardine ၏အကြောထိုးသွင်းခြင်းဖြင့် ဖြစ်ပေါ်လာသော NLRP3 ရောင်ရမ်းခြင်း၏အသက်သွင်းခြင်းသည် ကြွက်များတွင် သိသိသာသာကိုယ်အလေးချိန်ကျစေသည် (နေ့ 1: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 1.399၊ = 0 .9754 နေ့ 1- pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 နေ့ 2- pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172၊ P = 0.9979; နေ့ 2- pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172၊ P = 0.8409; နေ့ 3 : pcDNA3.1-alpha-2 giardine၊ 4၊ 30) = 0.8222၊ P = 0.0262 နေ့ 3- pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4 , 30) = 0.8222, P = 0.0083; Day 4: pcDNA3.1-alpha-A2၊ , F(4, 30) = 0.5620, P = 0.0012, Day 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5620, P < 0.0001, Day 5: pcDNA3.1-alpha - 2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P < 0.0001 Day 5: pcDNA3.1-alpha -7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P < 0.0001 Day 3 6: 1pcD alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0012, Day 6: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0006;နေ့ 7- pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P<0.0001 နေ့ 7- pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4 , 30) = 0.5369, P <0.0001)။ကပ်ပါးဝန်ကို duodenum (ပုံ 5c) တွင် အကဲဖြတ်ခဲ့သည်။မကုသရသေးသော အပြုသဘောဆောင်သော ထိန်းချုပ်မှုနှင့် အချည်းနှီးသော pcDNA3.1 vector ဖြင့် ထိုးသည့်အုပ်စုနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက၊ G. duodenalis trophozoites အရေအတွက်သည် α-2 giardine နှင့် α-7,3 giardine (pcDNA3.1-alpha) ဖြင့် ထိုးသည့်အုပ်စုများတွင် သိသိသာသာ လျော့ကျသွားသည် -2 giardine : ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0002, pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P<0.0001)။ထို့အပြင်၊ giardine alfa-7.3 သည် giardine alfa-2 (ANOVA၊ F(3, 24) = 1.209၊ P = 0.0081) ထက် ကြွက်များတွင် ပိုမိုကာကွယ်သည်။HE staining ၏ရလဒ်များကိုပုံတွင်ပြသထားသည်။5d–f။alpha-2 giardine နှင့် alpha-7.3 giardine ဖြင့် ထိုးထားသော ကြွက်များတွင် G. duodenalis နှင့် ထိုးထားသော ကြွက်များနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ဗလာ pcDNA3 vector .1 Zoom ဖြင့် ပေါင်းစပ်ထားသော duodenal တစ်သျှူး ဒဏ်ရာများ နည်းပါးကြောင်း ထင်ရှားပါသည်။(pcDNA3.1-alpha-2 giardine- ANOVA၊ F(3၊ 24) = 2.466၊ P = 0.0035 သို့မဟုတ် P = 0.0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine- ANOVA၊ F(3၊ 24) = 2.466၊ P = 0.0028 သို့မဟုတ် P = 0.0055) နှင့် လျှို့ဝှက်ကုဒ်ကို လျှော့ချခြင်း (pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA၊ F(3, 24) = 1.470၊ P = 0.0264 သို့မဟုတ် P = 0.0158; pcDNA3.1-alpha-7.3 ၊ F(3၊ 24) = 1.470၊ P = 0.0371 သို့မဟုတ် P = 0.0191)။ဤရလဒ်များက alpha-2 giardine နှင့် alpha-7,3 giardine သည် NLRP3 ရောင်ရမ်းမှုကို vivo တွင်အသက်သွင်းခြင်းဖြင့် G. duodenalis ၏ကူးစက်မှုကိုလျှော့ချနိုင်သည်ဟုအကြံပြုထားသည်။
G. duodenalis ကူးစက်မှုတွင် pcDNA3.1(+)-giardins ၏ အခန်းကဏ္ဍ။ကြွက်များကို ပြန်လည်ပေါင်းစပ် eukaryotic expression plasmids pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine သို့မဟုတ် pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine ဖြင့် ကာကွယ်ဆေးထိုးထားပြီး G. duodenalis cysts (ig) ဖြင့် စိန်ခေါ်ခဲ့သည်။PBS အုပ်စုနှင့် pcDNA3.1(+) + duodenal cyst ကုသမှုအုပ်စုအား အနုတ်လက္ခဏာထိန်းချုပ်မှုအုပ်စုများအဖြစ် အသုံးပြုခဲ့ပြီး duodenal cyst ကုသမှုအုပ်စုအား အပြုသဘောဆောင်သောထိန်းချုပ်မှုအုပ်စုအဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည်။စမ်းသပ်အုပ်စုနှင့် ကုသနည်း။b အမျိုးမျိုးသော ကုသမှုအုပ်စုတစ်ခုစီရှိ ကြွက်များ၏ MT ပမာဏကို စိန်ခေါ်ပြီးနောက် 7 ရက်ကြာ စောင့်ကြည့်ခဲ့သည်။ကြယ်ပွင့်များသည် G. duodenalis အုပ်စုနှင့် pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine အုပ်စု၊ *P < 0.05၊ **P < 0.01 နှင့် ***P < 0.001;ဒေါ်လာ သင်္ကေတ ($) သည် G. duodenalis အုပ်စုတစ်ခုစီနှင့် pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 jardine အုပ်စု၊ $$P<0.01 နှင့် $$$P<0.001 ကြား သိသာထင်ရှားသော ကွာခြားချက်ကို ညွှန်ပြသည်။c Parasitic load ကို duodenum (3 စင်တီမီတာရှည်) မှ duodenum မှ duodenal lavage 1 ml တွင် trophozoites အရေအတွက်ကိုရေတွက်ပြီး duodenum ၏တစ်စင်တီမီတာတွင်ကပ်ပါးကောင်အရေအတွက်အဖြစ်ဖော်ပြသည်။G. duodenalis ရောဂါကူးစက်မှုအုပ်စု၊ pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine အုပ်စုနှင့် pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine အုပ်စုအကြား ကွာခြားချက်များကို SPSS ဆော့ဖ်ဝဲလ်ဗားရှင်း 22.0 ကို အသုံးပြု၍ တစ်လမ်းသွား ANOVA ဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။**P<0.01 နှင့် ***P<0.001 တွင် သိသာထင်ရှားသော ခြားနားချက်များကို ကြယ်ပွင့်များက ဖော်ပြသည်။d duodenum အတွင်းရှိ Histopathological အပြောင်းအလဲများ။အနီရောင်မြှားများသည် villi ၏ပျက်စီးမှုကိုဖော်ပြသည်၊ အစိမ်းရောင်မြှားများသည် crypt များပျက်စီးမှုကိုဖော်ပြသည်။စကေးဘား- 100 µm။ငပုံ 1d ​​ရှိ အုပ်စုများအကြား ကွဲပြားမှုများကို SPSS ဆော့ဖ်ဝဲဗားရှင်း 22.0 ကို အသုံးပြု၍ တစ်လမ်းသွား ANOVA ဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ကြယ်ပွင့်များသည် *P<0.05 နှင့် **P<0.01 တွင် သိသာထင်ရှားသော ခြားနားချက်များကို ဖော်ပြသည်။လွတ်လပ်သောဇီဝစမ်းသပ်မှု ခုနစ်ခု၏ရလဒ်များ။ns၊ သိသိသာသာမဟုတ်ပါ (P > 0.05)
Giardia duodenum သည် လူနှင့် အခြားနို့တိုက်သတ္တဝါများ၏ လူသိများသော အူလမ်းကြောင်းကပ်ပါးပိုးတစ်မျိုးဖြစ်ပြီး giardiasis ကိုဖြစ်စေသည်။၂၀၀၄ ခုနှစ်တွင် ၎င်းကို WHO မှ လျစ်လျူရှုထားသော ရောဂါများ အစပျိုးမှုတွင် အထူးသဖြင့် လူမှုစီးပွားရေးနိမ့်ပါးသော အသိုင်းအဝိုင်းများတွင် ၆ နှစ်တာကာလအတွင်း ၎င်း၏အဖြစ်များမှု မြင့်မားခြင်းကြောင့် ပါဝင်ခဲ့သည်။G. duodenalis ကူးစက်မှုကို ခုခံအားတုံ့ပြန်မှုတွင် မွေးရာပါကိုယ်ခံအားစနစ်သည် အရေးပါသောအခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်ပါသည်။Mouse macrophages များသည် extracellular ထောင်ချောက်များကို ထုတ်လွှတ်ခြင်းဖြင့် G. duodenalis ကို မျိုချပြီးသတ်ရန် အစီရင်ခံထားပါသည်။ကျွန်ုပ်တို့၏ယခင်လေ့လာမှုများအရ G. duodenalis၊ ထိုးဖောက်မဟုတ်သောပြင်ပဆဲလ်ကပ်ပါးပိုးသည် p38 MAPK၊ ERK၊ NF-κB p65 နှင့် NLRP3 ရောင်ရမ်းမှုအချက်ပြလမ်းကြောင်းများကို မောက်စ် macrophages အတွင်းရှိ ရောင်ရမ်းမှုတုံ့ပြန်မှုများကိုထိန်းညှိပေးပြီး GEV မှထုတ်လွှတ်သော GEV သည် ဤလုပ်ငန်းစဉ်ကို ပိုမိုကောင်းမွန်စေကြောင်း ပြသခဲ့သည်။13]၊ 24]။သို့သော် GEV တွင် NLRP3 ရောင်ရမ်းမှုထိန်းချုပ်ထားသော ရောင်ရမ်းမှုတွင်ပါ၀င်သည့် PAMP အတိအကျနှင့် giardiasis ရှိ NLRP3 ရောင်ရမ်းခြင်း၏အခန်းကဏ္ဍတို့ကို ရှင်းလင်းဖော်ပြရန် ကျန်ရှိနေပါသည်။ဒီမေးခွန်းနှစ်ခုကို ရှင်းရှင်းလင်းလင်း သိနိုင်ဖို့ ဒီလေ့လာမှုကို ပြုလုပ်ခဲ့ပါတယ်။
NLRP3 ရောင်ရမ်းမှုသည် ကိုယ်ခံအားဆဲလ်များ၏ cytoplasm တွင်တည်ရှိပြီး ယူရစ်အက်ဆစ်ပုံဆောင်ခဲများ၊ အဆိပ်များ၊ ဘက်တီးရီးယားများ၊ ဗိုင်းရပ်စ်များနှင့် ကပ်ပါးပိုးများကဲ့သို့သော အမှုန်အမွှားများစွာဖြင့် အသက်သွင်းနိုင်သည်။ဘက်တီးရီးယားလေ့လာမှုများတွင် အဆိပ်အတောက်များကို ရောင်ရမ်းမှုအာရုံခံကိရိယာများကို လှုံ့ဆော်ပေးသည့် အဓိက PAMPs များအဖြစ် ဖော်ထုတ်ခဲ့ပြီး ရောင်ရမ်းမှုနှင့် ဆဲလ်သေများ [34]။Staphylococcus aureus [35] မှ hemolysin နှင့် Escherichia coli [36]၊ enterotoxin (NHE) [37] မှ hemolysin BL (HBL) ကဲ့သို့သော ဖွဲ့စည်းပုံအရ ကွဲပြားသော အဆိပ်များသည် NLRP3 ရောင်ရမ်းမှုကို လှုံ့ဆော်ပေးသည်။ဗိုင်းရပ်စ်လေ့လာမှုများက SARS-COV-2 စာအိတ် (E) ပရိုတင်း [38] နှင့် Zika ဗိုင်းရပ်စ် NS5 ပရိုတင်းကဲ့သို့သော ဗိုင်းရပ်စ်ပိုးပရိုတင်းများသည် NLRP3 receptor မှအသိအမှတ်ပြုထားသောအရေးကြီးသော PAMPs များဖြစ်ကြောင်းပြသခဲ့သည်။ကပ်ပါးလေ့လာမှုများတွင် Toxoplasma gondii၊ Trichomonas vaginalis [40]၊ Trypanosoma cruzi [41] နှင့် Leishmania [42] ကဲ့သို့သော ကပ်ပါးကောင်အများအပြားသည် ရောင်ရမ်းမှုဖြစ်စဉ်နှင့် ဆက်စပ်နေသည်ဟု အစီရင်ခံထားသည်။Toxoplasma gondii ၏ပြင်းထန်မှုနှင့်ဆက်စပ်သောသိပ်သည်းသော granule ပရိုတိန်း GRA35၊ GRA42 နှင့် GRA43 တို့သည် Lewis ကြွက် macrophages [43] ရှိ pyroptosis ၏လှုံ့ဆော်မှုအတွက်လိုအပ်သည်။ထို့အပြင်၊ အချို့သော Leishmania လေ့လာမှုများသည် ကပ်ပါးအမြှေးပါး lipophosphoglycan [44] သို့မဟုတ် zinc metalloprotease [45] ကဲ့သို့သော NLRP3 ရောင်ရမ်းမှုတွင် ပါဝင်သော မော်လီကျူးများကို အာရုံစိုက်ထားသည်။ဗီဇ၏ annexin-like alpha-giardin မိသားစုဝင်များထဲတွင်၊ alpha-1 giardin သည် mouse model [18] တွင် G. duodenalis ကိုကာကွယ်ပေးမည့်အလားအလာရှိသောကာကွယ်ဆေးအဖြစ်ပြသထားသည်။ကျွန်ုပ်တို့၏လေ့လာမှုတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် G. duodenalis virulence factor alpha-2 နှင့် alpha-7,3 giardines ကိုရွေးချယ်ထားပြီး၊ giardia နှင့်အတော်လေးနည်းသော်လည်း အစီရင်ခံချက်နည်းပါးသည်။ဤပစ်မှတ်မျိုးဗီဇနှစ်ခုကို ရောင်ရမ်းမှုကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန်အတွက် pcDNA3.1(+) eukaryotic expression system vector တွင် ပုံတူပွားထားသည်။
ကျွန်ုပ်တို့၏ mouse မော်ဒယ်တွင်၊ ခွဲထားသော ကစပေ့စ်အပိုင်းအစများသည် ရောင်ရမ်းမှုကို လှုံ့ဆော်မှု၏ အမှတ်အသားများအဖြစ် လုပ်ဆောင်သည်။လှုံ့ဆော်မှုအပေါ်တွင်၊ NLRP3 သည် ASC နှင့် အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်ပြီး procaspases များကိုစုဆောင်းကာ pro-IL-1β နှင့် pro-IL-18 တို့ကို ရင့်ကျက်သော IL-1β နှင့် IL-18 အသီးသီးအဖြစ် -18 သို့ ခွဲထုတ်ပေးသည့် တက်ကြွသော Caspases ကိုထုတ်ပေးသည်။ရောင်ရမ်းခြင်း (caspases-1၊ -4၊ -5 နှင့် -11) သည် မွေးရာပါ ကာကွယ်ရေးအတွက် အရေးပါသော cysteine ​​proteases များ၏ ထိန်းသိမ်းထားသော မိသားစုဖြစ်ပြီး ရောင်ရမ်းခြင်းနှင့် ပရိုဂရမ်ပြုထားသော ဆဲလ်သေ [46] တို့ပါဝင်သည်။Caspase-1 ကို canonical inflammasomes [47] ဖြင့် activated ဖြစ်ပြီး၊ caspases-4၊ -5 နှင့် -11 သည် atypical inflammasomes [48] များဖွဲ့စည်းစဉ်အတွင်း ကပ်စပရက်စ်-1 ကို ဖယ်ရှားထားသည်။ဤလေ့လာမှုတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် မော်ဒယ်တစ်ခုအဖြစ် mouse peritoneal macrophages ကိုအသုံးပြုပြီး G. duodenalis ကူးစက်မှုကိုလေ့လာမှုတွင် host NLRP3 ရောင်ရမ်းခြင်း၏အမှတ်အသားတစ်ခုအဖြစ် p20 caspase-1 တွင် cleaved caspase-1 ကို စုံစမ်းစစ်ဆေးခဲ့သည်။ရလဒ်များက alpha-giardins အများအပြားသည် ဘက်တီးရီးယားနှင့် ဗိုင်းရပ်စ်များပါ၀င်သည့် အဓိက ဗိုင်းရပ်စ်ပိုးများကို ရှာဖွေတွေ့ရှိမှုနှင့်အညီ ရောင်ရမ်းမှု၏ ပုံမှန်အသက်သွင်းမှုအတွက် တာဝန်ရှိကြောင်း ပြသခဲ့သည်။သို့သော်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏လေ့လာမှုသည် ပဏာမမျက်နှာပြင်တစ်ခုသာဖြစ်ပြီး၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ယခင်လေ့လာမှုက G. duodenalis ကူးစက်မှုတွင် ဂန္တဝင်ရောင်ရမ်းခြင်းနှင့် ဂန္တဝင်မဟုတ်သောရောင်ရမ်းခြင်း [13] ကိုတွေ့ရှိခဲ့သည့်အတိုင်း ဂန္ထဝင်မဟုတ်သောရောင်ရမ်းမှုဖြစ်စေသည့် အခြားသောမော်လီကျူးများရှိပါသည်။ထုတ်လုပ်ထားသော p20 caspase-1 သည် NLRP3 inflammasome နှင့် ဆက်စပ်မှုရှိမရှိ ထပ်မံဆုံးဖြတ်ရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် alpha-2 နှင့် alpha-7.3 giardins အား သော့မော်လီကျူးပရိုတိန်းဖော်ပြမှုအဆင့်နှင့် ASC oligomerization အဆင့်များကို ဆုံးဖြတ်ရန်အတွက် mouse peritoneal macrophages အဖြစ်သို့ ပြောင်းလဲကာ α-giardins နှစ်ခုစလုံးကို အသက်ဝင်ကြောင်း အတည်ပြုသည်။ ရောင်ရမ်းခြင်း NLRP3။ကျွန်ုပ်တို့၏ရလဒ်များသည် G. muris သို့မဟုတ် E. coli EPEC တစ်မျိုးတည်းဖြင့် Caco-2 ဆဲလ်များကို နှိုးဆွခြင်းသည် NLRP3, ASC, နှင့် caspase-1 ၏ fluorescence ပြင်းထန်မှုကို တိုးမြင့်စေနိုင်သည်ဟု အစီရင်ခံသော ကျွန်ုပ်တို့၏ရလဒ်များနှင့် အနည်းငယ်ကွာခြားပါသည်။ သိသိသာသာမဟုတ်သော်လည်း၊ G. muris နှင့် E. coli တို့၏ costimulation သည် ပရိုတင်းသုံးမျိုးအဆင့်ကို တိုးမြင့်စေသည် [49]။ဤကွာဟမှုသည် Giardia မျိုးစိတ်များ၊ ဆဲလ်လိုင်းများနှင့် အဓိကဆဲလ်များကို ရွေးချယ်ရာတွင် ကွဲပြားမှုများကြောင့် ဖြစ်နိုင်သည်။ကျွန်ုပ်တို့သည် G. duodenalis ကို ပို၍ ခံရနိုင်ချေရှိသော 5 ပတ်အရွယ် အမျိုးသမီး WT C57BL/6 ကြွက်များတွင် MCC950 ကို အသုံးပြု၍ vivo စစ်ဆေးမှုတွင်လည်း လုပ်ဆောင်ခဲ့ပါသည်။MCC950 သည် နာနိုမိုလာပြင်းအားများအတွင်း Canonical နှင့် Canonical မဟုတ်သော NLRP3 activation ကို ပိတ်ဆို့သည့် အစွမ်းထက်ပြီး ရွေးချယ်နိုင်သော သေးငယ်သော မော်လီကျူး NLRP3 inhibitor ဖြစ်သည်။MCC950 သည် NLRP3 အသက်သွင်းခြင်းကို ဟန့်တားသော်လည်း AIM2၊ NLRC4 နှင့် NLRP1 ရောင်ရမ်းမှုလမ်းကြောင်းများ သို့မဟုတ် TLR အချက်ပြသည့်လမ်းကြောင်းများ [27] ၏ အသက်သွင်းခြင်းကို မထိခိုက်စေပါ။MCC950 သည် NLRP3 အသက်သွင်းခြင်းကို ပိတ်ဆို့သော်လည်း NLRP3 စတင်ခြင်း၊ K+ efflux၊ Ca2+ ဝင်လာခြင်း သို့မဟုတ် NLRP3 နှင့် ASC အကြား အပြန်အလှန်အကျိုးသက်ရောက်မှုကို ဟန့်တားခြင်းမရှိပါ။ယင်းအစား၊ ၎င်းသည် ASC oligomerization [27] ကိုပိတ်ဆို့ခြင်းဖြင့် NLRP3 ရောင်ရမ်းမှုနိုးကြားမှုကို ဟန့်တားသည်။ထို့ကြောင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် giardine ထိုးပြီးနောက် NLRP3 ရောင်ရမ်းခြင်း၏အခန်းကဏ္ဍကိုဆုံးဖြတ်ရန် vivo လေ့လာမှုတစ်ခုတွင် MCC950 ကိုအသုံးပြုခဲ့သည်။အသက်သွင်းထားသော caspase-1 p10 သည် ရောင်ရမ်းမှုလိုလားသော cytokines pro-IL-1β နှင့် pro-IL-18 ကို အရွယ်ရောက်ပြီး IL-1β နှင့် IL-18 [50] အဖြစ်သို့ ဖယ်ထုတ်သည်။ဤလေ့လာမှုတွင်၊ MCC950 ပါသော သို့မဟုတ် မရှိပါက giardine ကုသထားသော ကြွက်များတွင် သွေးရည်ကြည် IL-1β ပမာဏကို NLRP3 ရောင်ရမ်းမှုကို အသက်သွင်းခြင်းရှိမရှိ ညွှန်ပြချက်အဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည်။မျှော်လင့်ထားသည့်အတိုင်း၊ MCC950 ကုသမှုသည် သွေးရည်ကြည် IL-1β အဆင့်ကို သိသိသာသာ လျော့ကျစေသည်။ဤဒေတာများသည် G. duodenalis giardin alfa-2 နှင့် giardin alfa-7.3 တို့သည် NLRP3 mouse inflammasome ကို အသက်သွင်းနိုင်သည်ကို ရှင်းရှင်းလင်းလင်း သက်သေပြနေသည်။
လွန်ခဲ့သည့်ဆယ်စုနှစ်များအတွင်း စုဆောင်းရရှိထားသော သိသာထင်ရှားသောအချက်အလက်များသည် IL-17A သည် G. muris ဆန့်ကျင်ဘက်ဆိုင်ရာ ကိုယ်ခံစွမ်းအားကို ထိန်းချုပ်ပေးကာ၊ IL-17RA အချက်ပြခြင်းကို လှုံ့ဆော်ပေးခြင်း၊ ပိုးသတ်ဆေးပပ်တိတ်များကို ထုတ်လုပ်ခြင်းနှင့် ဖြည့်စွက်အားသွင်းခြင်း [51] ကို ထိန်းညှိပေးကြောင်း သက်သေပြခဲ့သည်။သို့သော် Giardia ရောဂါပိုးသည် ငယ်ရွယ်သောအရွယ်ရောက်ပြီးသူများတွင် ပိုမိုဖြစ်ပွားလေ့ရှိပြီး ကြွက်များတွင် Giardia ကူးစက်မှုသည် IL-17A တုံ့ပြန်မှုကို မလုပ်ဆောင်နိုင်ခြင်းကြောင့် သုတေသီများက အခြားသော immunomodulatory Giardia ကို ရှာဖွေရန် လှုံ့ဆော်ပေးကြောင်း အစီရင်ခံထားသည်။helminth ကူးစက်မှု၏ယန္တရား။G. muris သည် E. coli EPEC မှ NLRP3 inflammasome ကို အသက်သွင်းနိုင်သည်၊ ၎င်းသည် antimicrobial peptides ထုတ်လုပ်မှုကို မြှင့်တင်ပေးပြီး ၎င်း၏တွယ်တာနိုင်စွမ်းနှင့် အူသိမ်အတွင်း trophozoites အရေအတွက်ကို လျှော့ချပေးနိုင်သည်၊ ထို့ကြောင့် အူမကြီး၏ပြင်းထန်မှုကို လျှော့ချပေးနိုင်သည် ဘက်စီလီကြောင့်ဖြစ်သောရောဂါများ။NLRP3 ရောင်ရမ်းမှု သည် အမျိုးမျိုးသော ရောဂါများ ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်ရေးတွင် ပါဝင်ပါသည်။လေ့လာမှုများအရ Pseudomonas aeruginosa သည် ဆဲလ်သေခြင်းကို ရှောင်ရှားရန်အတွက် macrophages တွင် autophagy ကို အစပျိုးပေးပြီး ဤလုပ်ငန်းစဉ်သည် NLRP3 inflammasome [53] ကို အသက်သွင်းခြင်းအပေါ် မူတည်ကြောင်း လေ့လာမှုများက ဖော်ပြသည်။N. caninum အတွက်၊ NLRP3 inflammasome ၏ ဓာတ်ပြုအောက်စီဂျင်မျိုးစိတ်များ-ဖျန်ဖြေပေးသည့် လုပ်ဆောင်ချက်သည် လက်ခံသူတွင် ၎င်း၏ပုံတူပွားမှုကို ကန့်သတ်ထားပြီး ဖြစ်နိုင်ချေရှိသော ကုထုံးပစ်မှတ် [9] ဖြစ်လာသည်။Paracoccidioides brasiliensis သည် ကြွက်ရိုးတွင်းခြင်ဆီမှဆင်းသက်လာသော dendritic ဆဲလ်များတွင် NLRP3 ရောင်ရမ်းမှုကို လှုံ့ဆော်ပေးသည်ကို တွေ့ရှိခဲ့ပြီး၊ ရောင်ရမ်းမှုဖြစ်စေသော cytokine IL-1β သည် အိမ်ရှင်ကာကွယ်ရေးတွင် အရေးပါသောအခန်းကဏ္ဍမှပါဝင်သည်ကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။L. amazonensis၊ L. major၊ L. braziliensis နှင့် L. infantum chagasi အပါအဝင် Leishmania မျိုးစိတ်များစွာသည် NLRP3 နှင့် ASC-dependent caspase-1 ကို macrophages နှင့် Leishmania ပိုးဝင်ခြင်းတွင် အသက်သွင်းသည်။NLRP3/ASC/caspase-1 gene [11] ချို့တဲ့သော ကြွက်များတွင် ကပ်ပါးမျိုးပွားခြင်းကို ပိုမိုကောင်းမွန်စေသည်။Zamboni et al ။Leishmania ရောဂါပိုးသည် ဆဲလ်အတွင်းကပ်ပါးပွားခြင်းကို ကန့်သတ်သည့် macrophages တွင် NLRP3 ရောင်ရမ်းမှုကို လှုံ့ဆော်ပေးကြောင်း အစီရင်ခံထားသည်။ထို့ကြောင့်၊ Leishmania သည် NLRP3 ကို ရှောင်ရှားခြင်းဗျူဟာအဖြစ် တားဆီးနိုင်သည်။vivo လေ့လာမှုများတွင် NLRP3 ရောင်ရမ်းမှုသည် Leishmania ကိုဖယ်ရှားရာတွင်ပါဝင်ခဲ့သော်လည်းတစ်ရှူး [54] ကိုမထိခိုက်စေပါ။အပြန်အလှန်အားဖြင့်၊ helminthiasis လေ့လာမှုများတွင် NLRP3 ရောင်ရမ်းခြင်း၏ အသက်ဝင်မှုသည် အစာအိမ်နှင့်အူလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ helminthiasis [12] ကို အကာအကွယ်ပေးသော အိမ်ရှင်၏ ခုခံအားကို ကျဆင်းစေသည်။Shigella သည် ကမ္ဘာတစ်ဝှမ်းတွင် ဝမ်းပျက်ဝမ်းလျှောဖြစ်စေသော အဓိက ဘက်တီးရီးယားများထဲမှ တစ်ခုဖြစ်သည်။ဤဘက်တီးရီးယားများသည် P2X7 receptor-mediated K+ efflux၊ ဓာတ်ပြုအောက်ဆီဂျင်မျိုးစိတ်များ၊ lysosomal acidification နှင့် mitochondrial ပျက်စီးမှုများမှတဆင့် IL-1β ထုတ်လုပ်မှုကို လှုံ့ဆော်ပေးနိုင်သည်။NLRP3 ရောင်ရမ်းမှုသည် Shigella [55] ကိုဆန့်ကျင်သော phagocytosis နှင့် macrophages ၏ဘက်တီးရီးယားပိုးသတ်ခြင်းဆိုင်ရာလုပ်ဆောင်မှုကိုအနုတ်လက္ခဏာဆောင်သည်။Plasmodium လေ့လာမှုများအရ AIM2၊ NLRP3 သို့မဟုတ် Caspase-1 ချို့တဲ့သော ကြွက်များသည် Plasmodium တွင် အမျိုးအစား 1 interferon မြင့်မားစွာ ထုတ်လုပ်နိုင်ပြီး Plasmodium ကူးစက်မှုကို ပိုမိုခံနိုင်ရည်ရှိကြောင်း ပြသခဲ့သည်။သို့ရာတွင်၊ ကြွက်များတွင် NLRP3 ရောင်ရမ်းမှုကို ဖြစ်ပေါ်စေသော ရောဂါပိုးဝင်ရောက်မှုကို လှုံ့ဆော်ပေးရာတွင် alpha-2 giardine နှင့် alpha-7.3 giardine တို့၏ အခန်းကဏ္ဍမှာ မရှင်းလင်းပါ။
ဤလေ့လာမှုတွင်၊ MCC950 မှ NLRP3 ရောင်ရမ်းမှုကို ဟန့်တားခြင်းသည် BW ကို လျော့ကျစေပြီး ကြွက်များတွင် အူလက်ဆေးရည်ရှိ trophozoites အရေအတွက်ကို တိုးလာစေပြီး duodenal တစ်ရှူးများတွင် ပြင်းထန်သောရောဂါဗေဒဆိုင်ရာပြောင်းလဲမှုများကို ဖြစ်ပေါ်စေပါသည်။Alpha-2 giardine နှင့် alpha-7.3 giardine တို့သည် host mouse NLRP3 inflammasome ကိုအသက်သွင်းသည်၊ ကြွက်၏ခန္ဓာကိုယ်အလေးချိန်ကိုတိုးစေသည်၊ အူလမ်းကြောင်းရှိအရည်များတွင် trophozoites အရေအတွက်ကိုလျှော့ချကာ၊ ရောဂါဗေဒဆိုင်ရာ duodenal ဒဏ်ရာများကိုသက်သာစေသည်။ဤရလဒ်များက G. duodenalis သည် alpha-2 giardine နှင့် alpha-7,3 giardine မှတစ်ဆင့် NLRP3 host inflammasome ကို အသက်သွင်းနိုင်ပြီး ကြွက်များတွင် G. duodenalis ၏ရောဂါဖြစ်ပွားမှုကို လျှော့ချနိုင်သည်ဟု အကြံပြုထားသည်။
စုပေါင်းအားဖြင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ရလဒ်များသည် alpha-2 နှင့် alpha-7.3 giardines တို့သည် NLRP3 host inflammasome ၏အသက်ဝင်မှုကိုဖြစ်စေပြီး ကြွက်များတွင် G. duodenalis ၏ကူးစက်မှုကိုလျှော့ချကြောင်း သက်သေပြသည်။ထို့ကြောင့်၊ ဤမော်လီကျူးများသည် giardiasis ကိုကာကွယ်ရန်အတွက်အလားအလာရှိသောပစ်မှတ်များဖြစ်သည်။
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS၊ Liang AAM၊ Huang AHC၊ Sergi KM၊ Kam JKM။Giardiasis: ခြုံငုံသုံးသပ်ချက်။Pat Inflamm သည် ဆေးဝါးများနှင့် မတည့်ကြောင်း မကြာသေးမီက ထုတ်ဖော်ခဲ့သည်။2019; 13:134–43။
Escobedo AA၊ Tsimerman S. Giardiasis - ဆေးဝါးကုထုံး၏ပြန်လည်သုံးသပ်ခြင်း။ဆေးဝါးပညာရှင်၏ ကျွမ်းကျင်သောအမြင်။၂၀၀၇;၈:၁၈၈၅–၉၀၂။
Tian Huafeng၊ Chen Bin၊ Wen Jianfeng။Giardiasis, ဆေးယဉ်ပါးမှုနှင့်ပစ်မှတ်အသစ်များရှာဖွေတွေ့ရှိ။Disorder မူးယစ်ဆေးဝါးပစ်မှတ်များကို ကူးစက်သည်။2010;10:295–302။
Wang Z၊ Zhang X၊ Xiao Yi၊ Zhang W၊ Wu X၊ Qin T စသဖြင့် NLRP3 ရောင်ရမ်းခြင်းနှင့် ရောင်ရမ်းသောရောဂါများ။အောက်ဆိုဒ် Med Cell Longev2020;2020:4063562။
Chen GY၊ Núñez G. အူရောင်ရမ်းခြင်းနှင့် ကင်ဆာများတွင် ရောင်ရမ်းခြင်း၏ အခန်းကဏ္ဍ။အစာအိမ်ရောဂါ။2011;၁၄၁:၁၉၈၆–၉၉။
Pellegrini C၊ Antonioli L၊ Lopez-Castejon G၊ Blandizzi C၊ Fornai M. Canonical နှင့် atypical NLRP3 inflammasome activation သည် ကိုယ်ခံအား ခံနိုင်ရည်ရှိမှုနှင့် အစာအိမ်ရောင်ရမ်းမှု၏ လမ်းဆုံလမ်းခွများတွင် ဖြစ်သည်။pre-ခုခံအား။၂၀၁၇; ၈:၃၆။
Li L၊ Wang XC၊ Gong PT၊ Zhang N၊ Zhang X၊ Li S၊ et al ။ROS-mediated NLRP3 inflammasome activation သည် N. caninum ကူးစက်မှုကို တုံ့ပြန်ရာတွင် ပါဝင်ပါသည်။ကပ်ပါးကောင်။2020; 13:449။